作者：武爱玲，潘金火，金勇群
【摘要】 目的 建立点穴消痛膏的质量标准。方法 采用薄层色谱法对制剂中丁香、肉桂、洋金花进行定性鉴别；采用紫外分光光度法对乌头中酯型生物碱进行检查；采用高效液相色谱法对制剂中士的宁含量进行测定。结果 薄层色谱能检出丁香、肉桂、洋金花；乌头碱在0.256～2.56 mg/25 mL范围内线性关系良好，r=0.999 8，平均回收率为99.7%，RSD=2.3%；士的宁在0.307 5～3.075 μg范围内呈良好的线性关系，r=0.999 3，平均回收率为100.45%， RSD=2.75%。结论 本实验建立的方法简便、快捷，重现性好，可用于该制剂的质量控制。
【关键词】 点穴消痛膏；质量标准；酯型生物碱；士的宁
Abstract：Objective To establish the quality standard for Dianxue Xiaotong Paste. Methods Flos Caryophylli， Cortex Cinnamomi and Flos Daturae were identified by TLC， ester-type alkaloids of Radix Aconiti and Radix Aconiti Kusnezoffii was determined by ultraviolet spectrophotometry， and Strychnine was determined by HPLC. Results Flos Caryophylli， Cortex Cinnamomi and Flos Daturae could be detected by TLC. Aconitine showed a good linear relationship in the range of 0.256～2.56 mg/25 mL， r=0.999 8.
The average recovery was 99.7%， and RSD was 2.3%. The linearity of Strychnine was found in the range of 0.307 5～3.075 μg， r=0.999 3. The average recovery was 100.45%， and RSD was 2.75%. Conclusion The established methods are simple， quick and good reproductive. This study provides methods for the quality control of Dianxue Xiaotong paste.
Key words：Dianxue Xiaotong paste；quality standard；ester-type alkaloids；Strychnine
点穴消痛膏由生川乌、生草乌、马钱子、洋金花、丁香、肉桂等中药经优选工艺后精制而成，具有点穴舒经、散瘀止痛之效，用于颈椎炎、腰背痛、四肢关节扭伤等。方中生川乌、生草乌的主要化学成分是以乌头碱为代表的酯型生物碱，由于毒性剧烈，故应对膏药中的酯型生物碱成分建立检查项。马钱子中的士的宁和马钱子碱为其主要活性成分，但超剂量又会引起毒副反应。为保证临床用药安全有效，除建立3味药的鉴别方法外，制定酯型生物碱的检查项及士的宁碱的含量测定方法并规定其含量限度范围是十分必要的。士的宁含量测定方法有紫外-可见分光光度法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法[1]等。本试验采用薄层色谱法对制剂中丁香、肉桂、洋金花3味药进行定性鉴别，并采用分光光度法对乌头中酯型生物碱进行检查，采用高效液相色谱法对制剂中士的宁进行了含量测定。
1 仪器与试药
日本岛津UV-2401紫外分光光度计；日本岛津LC-10AD高效液相色谱仪，岛津SPD-10AVP紫外检测器，HT-230A柱温箱，HW色谱工作站。AichromBond-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)。
士的宁(批号110705-200005)、乌头碱(批号110720- 200409)、丁香酚(批号725-200209)、桂皮醛(批号110710- 200212)、氢溴酸东莨菪碱(批号100049-200308)对照品均购自中国药品生物制品检定所；3批中试产品(批号051208、051210、051212)由江苏七O七天然制药有限公司生产。硅胶G(青岛海洋化工厂，薄层色谱用)；所有试剂均为分析纯。
2 薄层色谱的鉴别
2.1 丁香
取膏体，剪碎，称取5 g，转移至具塞锥形瓶中，加无水乙醇50 mL，浸渍1 h后，超声15 min，离心。取上清液，作为供试品溶液。另取丁香酚对照品，加无水乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。再按处方取不含丁香的其它药材，按本品工艺及上述供试品制备方法，制成阴性对照溶液。吸取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一块硅胶G板上，以石油醚(30～60 ℃)-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛浓硫酸试液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照液无此斑点。
2.2 肉桂
取桂皮醛对照品，加无水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。再按处方取不含肉桂的其它药材，按本品工艺及上述供试品制备方法，制成阴性对照溶液。吸取“2.1”中的供试品溶液和上述对照品溶液、阴性对照溶液各10 μL，点于同一块硅胶G板上，以石油醚(60～90 ℃)-醋酸乙酯(17∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼硫酸试液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照液无此斑点。
2.3 洋金花
取膏体，剪碎，称取10 g，转移至具塞锥形瓶中，加pH 3～4的无水乙醇100 mL，浸渍1 h后，超声15 min，离心。取上清液，回收乙醇，加0.6 mol/L HCl 10 mL溶解，转移至分液漏斗中，用乙醚萃取2次(20、10 mL)，取酸水层，滴加浓氨试液调节pH值至8～9，用氯仿萃取3次，每次10 mL。合并氯仿液，蒸干，105 ℃放置0.5 h，取出放冷后，残渣用甲醇少量溶解，作为供试品溶液。另取氢溴酸东莨菪碱对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。再按处方取不含洋金花的其它药材，按本品工艺及上述供试品制备方法，制成阴性对照溶液。吸取上述供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一块硅胶G板上，以醋酸乙酯-甲醇-浓氨(17∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照液无此斑点。
3 酯型生物碱的检查
3.1 对照品溶液的制备
精密称取乌头碱对照品约10.24 mg，置10 mL量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度。
3.2 标准曲线的制备
分别精密量取对照品溶液0、0.25、0.50、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置25 mL量瓶中，均加无水乙醇使成2.5 mL，各精密加入碱性盐酸羟胺试液1.5 mL，摇匀，在60～65 ℃水浴中保温10 min，放冷，加高氯酸铁试液13 mL，摇匀，放置5 min，精密加入高氯酸试液8 mL，用高氯酸铁试液稀释至刻度，摇匀，放置15 min，以第一份为空白，在520 nm处测定吸收度[2]。以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程为：C= 8.824A-3.746，r=0.999 8。试验结果表明：乌头碱含量在0.256～2.56 mg/25 mL范围内，其吸收度与乌头碱浓度呈良好的线性关系。
3.3 供试品溶液的制备
取膏体，剪碎，精密称取10 g，定量转移至具塞锥形瓶中，加入pH 3～4的无水乙醇150 mL，浸渍1 h后，超声30 min，离心，取上清液；沉淀再用适量上述无水乙醇洗涤1次，离心，取上清液，合并，回收乙醇，加0.6 mol/L HCl 10 mL溶解，定量转移至分液漏斗中，用乙醚萃取3次(20、10、10 mL)，取酸水层，滴加氨试液调节pH值至8～9，用氯仿萃取3次，每次10 mL，合并氯仿液，蒸干，残渣加无水乙醇适量使溶解，转入5 mL量瓶中，用无水乙醇分次洗涤容器，洗涤液并入量瓶中，再加无水乙醇至刻度，摇匀。精密量取上述溶液2.5 mL，置25 mL量瓶中，精密加入碱性盐酸羟胺试液1.5 mL，摇匀，在60～65 ℃水浴中保温10 min，放冷，加高氯酸铁试液13 mL，摇匀，放置5 min，精密加入高氯酸试液8 mL，用高氯酸铁试液稀释至刻度，摇匀，放置15 min，即得供试品溶液。
3.4 精密度试验
取对照品溶液，显色后，在520 nm波长处测定吸收度，连续测定6次，平均吸收度为0.539，RSD=2.7%。
3.5 稳定性试验
取供试品溶液，显色后，在520 nm波长处测定吸收度，每次测定间隔1 h，连续考察7 h，平均吸收度为0.09，RSD=2.02%。
3.6 重复性试验
取同一批次的样品5份，用“3.3”项下方法制备供试液，在520 nm波长处测定吸收度，采用随行标准，用外标二点法计算，RSD=2.6%，结果表明重复性良好。
3.7 含量测定
按照“3.3”项中样品制备方法，制得3批样品的供试液，在520 nm波长处测定吸收度，采用随行标准，用外标二点法计算。不同批次样品的测定结果分别为0.08、0.10、0.11 mg/g。本品每克含酯型生物碱以乌头碱(C34H47NO11)计，不得少于0.12 mg。
3.8 加样回收率试验
取同批号已知含量的供试品，去除褙衬材料后，剪碎，精密称取5 g，共5份，各精密加入浓度为1.024 mg/mL的对照品溶液0.5 mL，放置10 min，按供试品溶液制备方法制成供试品溶液。用与样品测定相同的方法依法测定吸收度，计算加样回收率，其平均回收率为99.7%，RSD=2.3%。
4 士的宁的含量测定
4.1 色谱条件
Aichrom Bond-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水-醋酸-三乙胺(11∶88∶0.9∶0.1)组成；检测波长为254 nm，柱温30 ℃，流速1 mL/min，理论塔板数按士的宁峰计算应不低于4 000。
4.2 对照品溶液的制备
取士的宁对照品适量，精密称定，加氯仿制成0.061 5 mg/mL溶液，摇匀，作为对照品溶液。
4.3 线性关系考察
分别精密吸取浓度为0.061 5 mg/mL的士的宁对照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL至10 mL量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪。以进样量(μg)对平均峰面积A进行回归处理，得回归方程：A=27 617V+11 870， r=0.999 3，指标成分进样量在0.307 5～3.075 μg之间，线性关系较好。
4.4 供试品溶液的制备
取膏体，剪碎，精密称定4 g，加氨水4 mL，再加氯仿40 mL，回流提取2 h，滤过，再同上提取1次，合并氯仿液，置分液漏斗中，以3%硫酸萃取3次，每次20 mL，合并酸水层，用浓氨水调pH值9～10，再用氯仿萃取3次，每次20 mL，合并氯仿液，蒸干，残渣用氯仿溶解并转移至10 mL量瓶中，定容即得[3]。
4.5 空白试验
以本品制剂方法制备成不含马钱子的空白对照膏体，用与供试品溶液相同的方法制得阴性对照液。在上述色谱条件下，精密吸取5 μL士的宁阴性对照液，连续进样3次。结果表明，空白对照液未检出与士的宁对照液对应的色谱峰，视为空白无干扰。色谱图见图1。
4.6 精密度试验
精密吸取对照品溶液5 μL，连续进样5次，测得士的宁峰面积积分值，相对标准偏差RSD=1.8%。
4.7 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液5 μL，每间隔2 h进样1次，连续考察8 h，测得士的宁峰面积，相对标准偏差RSD=2.7%。结果表明，指标成分在8 h内比较稳定。
4.8 重复性试验
取同批号的膏体，剪碎，精密称定4 g，共5份，分别用与“4.4”项下供试品溶液制备中相同的方法制得供试液，在“4.1”条件下，精密吸取5 μL注入液相色谱仪，测得样品中指标成分士的宁的含量，RSD=2.2%，表明重复性良好。
4.9 含量测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。以外标法计算，3批样品士的宁含量分别为0.343、0.355、0.382 mg/g。本品每克含马钱子以士的宁计应为0.288～0.432 mg。
4.10 加样回收率试验
取同批号的膏体(每1 g样品含士的宁0.355 mg)，剪碎，精密称定2 g，共5份，分别置100 mL烧瓶中，各精密加入浓度为0.061 5 mg/mL的士的宁对照液10 mL，用“4.4”项下方法制得供试液。进样，测定，计算回收率，结果见表2。表2 加样回收率测定结果(略)
5 讨论
酯型生物碱检查曾考虑采用薄层色谱法，但由于样品干扰较严重，最后采用比色法。
马钱子中含有多种生物碱，士的宁为马钱子的最主要的成分，约占总生物碱的45%，且马钱子碱的药效只有士的宁的1/40[4]，同时，本剂型为外用膏剂，故只对马钱子中的士的宁进行了含量测定。
关于士的宁含量测定中供试品溶液制备方法，曾考察过超声提取法再用无水乙醇定容的方法，该法较简单，但样品经无水乙醇定容注入液相色谱仪后，在士的宁主峰前出现一小分叉；用氨性氯仿热回流提取，用氯仿定容就无此现象，且图谱清晰，故采用氯仿定容。
【参考文献】
[1] 金红宇，田金改，张 莉，等.反相HPLC法测定马钱子中士的宁和马钱子碱的含量[J].中国药事，2005，19(4)：219－221.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社，2005.27.
[3] 匡海学.中药化学[M].北京：中国中医药出版社，2003.358－362.
[4] 康廷国.中药鉴定学[M].北京：中国中医药出版社，2003.370.
【摘要】 目的 建立点穴消痛膏的质量标准。方法 采用薄层色谱法对制剂中丁香、肉桂、洋金花进行定性鉴别；采用紫外分光光度法对乌头中酯型生物碱进行检查；采用高效液相色谱法对制剂中士的宁含量进行测定。结果 薄层色谱能检出丁香、肉桂、洋金花；乌头碱在0.256～2.56 mg/25 mL范围内线性关系良好，r=0.999 8，平均回收率为99.7%，RSD=2.3%；士的宁在0.307 5～3.075 μg范围内呈良好的线性关系，r=0.999 3，平均回收率为100.45%， RSD=2.75%。结论 本实验建立的方法简便、快捷，重现性好，可用于该制剂的质量控制。
【关键词】 点穴消痛膏；质量标准；酯型生物碱；士的宁
Study on the Quality Standard for Dianxue Xiaotong Paste
WU Ai-ling， PAN Jin-huo， JIN Yong-qun
Nanjing University of TCM， Nanjing 210029， China
Abstract：Objective To establish the quality standard for Dianxue Xiaotong Paste. Methods Flos Caryophylli， Cortex Cinnamomi and Flos Daturae were identified by TLC， ester-type alkaloids of Radix Aconiti and Radix Aconiti Kusnezoffii was determined by ultraviolet spectrophotometry， and Strychnine was determined by HPLC. Results Flos Caryophylli， Cortex Cinnamomi and Flos Daturae could be detected by TLC. Aconitine showed a good linear relationship in the range of 0.256～2.56 mg/25 mL， r=0.999 8.
The average recovery was 99.7%， and RSD was 2.3%. The linearity of Strychnine was found in the range of 0.307 5～3.075 μg， r=0.999 3. The average recovery was 100.45%， and RSD was 2.75%. Conclusion The established methods are simple， quick and good reproductive. This study provides methods for the quality control of Dianxue Xiaotong paste.
Key words：Dianxue Xiaotong paste；quality standard；ester-type alkaloids；Strychnine
点穴消痛膏由生川乌、生草乌、马钱子、洋金花、丁香、肉桂等中药经优选工艺后精制而成，具有点穴舒经、散瘀止痛之效，用于颈椎炎、腰背痛、四肢关节扭伤等。方中生川乌、生草乌的主要化学成分是以乌头碱为代表的酯型生物碱，由于毒性剧烈，故应对膏药中的酯型生物碱成分建立检查项。马钱子中的士的宁和马钱子碱为其主要活性成分，但超剂量又会引起毒副反应。为保证临床用药安全有效，除建立3味药的鉴别方法外，制定酯型生物碱的检查项及士的宁碱的含量测定方法并规定其含量限度范围是十分必要的。士的宁含量测定方法有紫外-可见分光光度法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法[1]等。本试验采用薄层色谱法对制剂中丁香、肉桂、洋金花3味药进行定性鉴别，并采用分光光度法对乌头中酯型生物碱进行检查，采用高效液相色谱法对制剂中士的宁进行了含量测定。
1 仪器与试药
日本岛津UV-2401紫外分光光度计；日本岛津LC-10AD高效液相色谱仪，岛津SPD-10AVP紫外检测器，HT-230A柱温箱，HW色谱工作站。AichromBond-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)。
士的宁(批号110705-200005)、乌头碱(批号110720- 200409)、丁香酚(批号725-200209)、桂皮醛(批号110710- 200212)、氢溴酸东莨菪碱(批号100049-200308)对照品均购自中国药品生物制品检定所；3批中试产品(批号051208、051210、051212)由江苏七O七天然制药有限公司生产。硅胶G(青岛海洋化工厂，薄层色谱用)；所有试剂均为分析纯。
2 薄层色谱的鉴别
2.1 丁香
取膏体，剪碎，称取5 g，转移至具塞锥形瓶中，加无水乙醇50 mL，浸渍1 h后，超声15 min，离心。取上清液，作为供试品溶液。另取丁香酚对照品，加无水乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。再按处方取不含丁香的其它药材，按本品工艺及上述供试品制备方法，制成阴性对照溶液。吸取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一块硅胶G板上，以石油醚(30～60 ℃)-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛浓硫酸试液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照液无此斑点。
2.2 肉桂
取桂皮醛对照品，加无水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。再按处方取不含肉桂的其它药材，按本品工艺及上述供试品制备方法，制成阴性对照溶液。吸取“2.1”中的供试品溶液和上述对照品溶液、阴性对照溶液各10 μL，点于同一块硅胶G板上，以石油醚(60～90 ℃)-醋酸乙酯(17∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼硫酸试液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照液无此斑点。
2.3 洋金花
取膏体，剪碎，称取10 g，转移至具塞锥形瓶中，加pH 3～4的无水乙醇100 mL，浸渍1 h后，超声15 min，离心。取上清液，回收乙醇，加0.6 mol/L HCl 10 mL溶解，转移至分液漏斗中，用乙醚萃取2次(20、10 mL)，取酸水层，滴加浓氨试液调节pH值至8～9，用氯仿萃取3次，每次10 mL。合并氯仿液，蒸干，105 ℃放置0.5 h，取出放冷后，残渣用甲醇少量溶解，作为供试品溶液。另取氢溴酸东莨菪碱对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。再按处方取不含洋金花的其它药材，按本品工艺及上述供试品制备方法，制成阴性对照溶液。吸取上述供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一块硅胶G板上，以醋酸乙酯-甲醇-浓氨(17∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照液无此斑点。
3 酯型生物碱的检查
3.1 对照品溶液的制备
精密称取乌头碱对照品约10.24 mg，置10 mL量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度。
3.2 标准曲线的制备
分别精密量取对照品溶液0、0.25、0.50、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置25 mL量瓶中，均加无水乙醇使成2.5 mL，各精密加入碱性盐酸羟胺试液1.5 mL，摇匀，在60～65 ℃水浴中保温10 min，放冷，加高氯酸铁试液13 mL，摇匀，放置5 min，精密加入高氯酸试液8 mL，用高氯酸铁试液稀释至刻度，摇匀，放置15 min，以第一份为空白，在520 nm处测定吸收度[2]。以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程为：C= 8.824A-3.746，r=0.999 8。试验结果表明：乌头碱含量在0.256～2.56 mg/25 mL范围内，其吸收度与乌头碱浓度呈良好的线性关系。
3.3 供试品溶液的制备
取膏体，剪碎，精密称取10 g，定量转移至具塞锥形瓶中，加入pH 3～4的无水乙醇150 mL，浸渍1 h后，超声30 min，离心，取上清液；沉淀再用适量上述无水乙醇洗涤1次，离心，取上清液，合并，回收乙醇，加0.6 mol/L HCl 10 mL溶解，定量转移至分液漏斗中，用乙醚萃取3次(20、10、10 mL)，取酸水层，滴加氨试液调节pH值至8～9，用氯仿萃取3次，每次10 mL，合并氯仿液，蒸干，残渣加无水乙醇适量使溶解，转入5 mL量瓶中，用无水乙醇分次洗涤容器，洗涤液并入量瓶中，再加无水乙醇至刻度，摇匀。精密量取上述溶液2.5 mL，置25 mL量瓶中，精密加入碱性盐酸羟胺试液1.5 mL，摇匀，在60～65 ℃水浴中保温10 min，放冷，加高氯酸铁试液13 mL，摇匀，放置5 min，精密加入高氯酸试液8 mL，用高氯酸铁试液稀释至刻度，摇匀，放置15 min，即得供试品溶液。
3.4 精密度试验
取对照品溶液，显色后，在520 nm波长处测定吸收度，连续测定6次，平均吸收度为0.539，RSD=2.7%。
3.5 稳定性试验
取供试品溶液，显色后，在520 nm波长处测定吸收度，每次测定间隔1 h，连续考察7 h，平均吸收度为0.09，RSD=2.02%。
3.6 重复性试验
取同一批次的样品5份，用“3.3”项下方法制备供试液，在520 nm波长处测定吸收度，采用随行标准，用外标二点法计算，RSD=2.6%，结果表明重复性良好。
3.7 含量测定
按照“3.3”项中样品制备方法，制得3批样品的供试液，在520 nm波长处测定吸收度，采用随行标准，用外标二点法计算。不同批次样品的测定结果分别为0.08、0.10、0.11 mg/g。本品每克含酯型生物碱以乌头碱(C34H47NO11)计，不得少于0.12 mg。
3.8 加样回收率试验
取同批号已知含量的供试品，去除褙衬材料后，剪碎，精密称取5 g，共5份，各精密加入浓度为1.024 mg/mL的对照品溶液0.5 mL，放置10 min，按供试品溶液制备方法制成供试品溶液。用与样品测定相同的方法依法测定吸收度，计算加样回收率，其平均回收率为99.7%，RSD=2.3%。
4 士的宁的含量测定
4.1 色谱条件
Aichrom Bond-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水-醋酸-三乙胺(11∶88∶0.9∶0.1)组成；检测波长为254 nm，柱温30 ℃，流速1 mL/min，理论塔板数按士的宁峰计算应不低于4 000。
4.2 对照品溶液的制备
取士的宁对照品适量，精密称定，加氯仿制成0.061 5 mg/mL溶液，摇匀，作为对照品溶液。
4.3 线性关系考察
分别精密吸取浓度为0.061 5 mg/mL的士的宁对照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL至10 mL量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪。以进样量(μg)对平均峰面积A进行回归处理，得回归方程：A=27 617V+11 870， r=0.999 3，指标成分进样量在0.307 5～3.075 μg之间，线性关系较好。
4.4 供试品溶液的制备
取膏体，剪碎，精密称定4 g，加氨水4 mL，再加氯仿40 mL，回流提取2 h，滤过，再同上提取1次，合并氯仿液，置分液漏斗中，以3%硫酸萃取3次，每次20 mL，合并酸水层，用浓氨水调pH值9～10，再用氯仿萃取3次，每次20 mL，合并氯仿液，蒸干，残渣用氯仿溶解并转移至10 mL量瓶中，定容即得[3]。
4.5 空白试验
以本品制剂方法制备成不含马钱子的空白对照膏体，用与供试品溶液相同的方法制得阴性对照液。在上述色谱条件下，精密吸取5 μL士的宁阴性对照液，连续进样3次。结果表明，空白对照液未检出与士的宁对照液对应的色谱峰，视为空白无干扰。色谱图见图1。
4.6 精密度试验
精密吸取对照品溶液5 μL，连续进样5次，测得士的宁峰面积积分值，相对标准偏差RSD=1.8%。
4.7 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液5 μL，每间隔2 h进样1次，连续考察8 h，测得士的宁峰面积，相对标准偏差RSD=2.7%。结果表明，指标成分在8 h内比较稳定。
4.8 重复性试验
取同批号的膏体，剪碎，精密称定4 g，共5份，分别用与“4.4”项下供试品溶液制备中相同的方法制得供试液，在“4.1”条件下，精密吸取5 μL注入液相色谱仪，测得样品中指标成分士的宁的含量，RSD=2.2%，表明重复性良好。
4.9 含量测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。以外标法计算，3批样品士的宁含量分别为0.343、0.355、0.382 mg/g。本品每克含马钱子以士的宁计应为0.288～0.432 mg。
4.10 加样回收率试验
取同批号的膏体(每1 g样品含士的宁0.355 mg)，剪碎，精密称定2 g，共5份，分别置100 mL烧瓶中，各精密加入浓度为0.061 5 mg/mL的士的宁对照液10 mL，用“4.4”项下方法制得供试液。进样，测定，计算回收率，结果见表2。表2 加样回收率测定结果(略)
5 讨论
酯型生物碱检查曾考虑采用薄层色谱法，但由于样品干扰较严重，最后采用比色法。
马钱子中含有多种生物碱，士的宁为马钱子的最主要的成分，约占总生物碱的45%，且马钱子碱的药效只有士的宁的1/40[4]，同时，本剂型为外用膏剂，故只对马钱子中的士的宁进行了含量测定。
关于士的宁含量测定中供试品溶液制备方法，曾考察过超声提取法再用无水乙醇定容的方法，该法较简单，但样品经无水乙醇定容注入液相色谱仪后，在士的宁主峰前出现一小分叉；用氨性氯仿热回流提取，用氯仿定容就无此现象，且图谱清晰，故采用氯仿定容。
【参考文献
】
[1] 金红宇，田金改，张 莉，等.反相HPLC法测定马钱子中士的宁和马钱子碱的含量[J].中国药事，2005，19(4)：219－221.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社，2005.27.
[3] 匡海学.中药化学[M].北京：中国中医药出版社，2003.358－362.
[4] 康廷国.中药鉴定学[M].北京：中国中医药出版社，2003.370.