作者：孙颖，刘同祥，胡舒，李梦，张宗申
【摘要】 目的 寻找鸡内金淀粉酶的最佳炮制工艺和理化性质。方法 50 ℃烘干后，用磷酸缓冲液提取鸡内金淀粉酶，分别在不同温度、pH值、不同金属离子处理下测定酶活力，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果 鸡内金淀粉酶的最适反应pH、最适反应温度和最适底物浓度分别为8.67、50 ℃和1.8 g/mL；实验条件下，以淀粉为底物的Km是0.92； Ca2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+等金属离子对淀粉酶活性有抑制作用；聚丙烯酰胺凝胶电泳显示一条谱带，表明鸡内金中可能无淀粉酶同工酶存在。结论 鸡内金炮制加工过程中要注意金属离子的影响。
【关键词】 鸡内金；淀粉酶；理化性质；同工酶
Abstract：Objective To search for the optimal processing procedure and physico-chemical properties of Endothelium corneum amylase. Methods After dried under 50 ℃， amylase was extracted from Endothelium corneum with phosphate-buffered saline. The amylase activity was examined at different temperature， pH and different metal ions， and amylase isozyme was discerned on PAGE. Results The optimal pH， optimal temperature， and optimal substrate concentration for amylase activity were 8.67， 50 ℃ and 1.8 g/mL， respectively. Under the experimental conditions， the amylase Km was 0.92 (starch was used as substrate of amylase). Four metal ions tested， including Ca2+， Fe2+， Zn2+， Mn2+， could inhibit the amylase activity to some extent. Furthermore， it showed one amylase isozyme band using PAGE， suggesting only one amylase isozyme existing in the Endothelium corneum tentatively. Conclusion The effects of metal ions should be considered in the process of Endothelium corneum amylase.
Key words：Endothelium corneum；amylase；physico-chemical properties；isozyme
鸡内金是雉科动物家鸡的干燥沙囊角质内壁，具有健胃消食、涩精止遗的功效，临床多用于食积不消、呕吐泻痢、小儿疳积、遗尿、遗精等症。现代药理研究认为，鸡内金主要含有胃激素、角蛋白、氨基酸等成分，有增加胃液分泌量和胃肠消化能力、加快胃的排空速率等作用[1]。目前对鸡内金中起作用成分的研究还不够深入，特别是对鸡内金所含的生化物质及其理化性质研究还缺乏深度。本实验探讨了鸡内金淀粉酶的理化性质和同工酶谱，其结果对深入研究鸡内金药理作用和进一步开发鸡内金产品具有一定的意义。
1 实验材料
鸡内金，大连市炮台食品公司提供。其余试剂均为分析纯。分光光度计[7202B型，尤尼柯(上海)仪器有限公司]、垂直板电泳仪(JM-250型，大连捷迈科贸有限公司)。
2 实验方法
2.1 鸡内金淀粉酶液的制备
称取生品鸡内金65 g(湿重)、50 ℃烘干、粉碎成粗粉、加217 mL的磷酸缓冲液(pH 7.0，0.05 mol/L)，在30 ℃恒温水浴锅中保温3 h(每隔30 min搅拌一次)浸提，用纱布过滤，滤液静置1 h，离心(3 000 r/min，30 min)，收集上清液于-4 ℃冰箱中保存。
2.2 酶活力测定
参考文献
[2]方法，采用碘-淀粉比色法进行酶活力测定。2.3 同工酶的检测
参考文献
[3]用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行同工酶的检测。采用恒温电泳方式，整个电泳过程在4 ℃进行。3 结果
3.1 粗酶提取液pH值及加入量的考察
用不同量的酶提取液分别作用于1 mL基质缓冲液，在系列pH值7.73、8.04、8.34、8.67、9.18的磷酸缓冲液作用下，测定酶活力。结果见表1。表1 酶液量及pH对酶活力影响的优化（略）
3.2 酶反应的最适底物浓度
用0.5 mL酶提取液，在pH 8.67条件下，配制不同底物浓度溶液，然后测定各浓度下的酶活力，在底物浓度达到1.8 mg/mL时，酶催化速度达到最大，表明该底物浓度已使酶活性中心达到饱和(见图1)。
3.3 淀粉酶催化反应的最适pH
取0.5 mL酶提取液，在不同的pH值条件下测定酶活力。结果，在pH 8.67时酶反应速度最快，当pH高于8.67时淀粉酶活性迅速下降(见图2)。
3.4 酶反应的最适温度
用0.5 mL酶提取液，在pH 8.67、底物浓度1.8 mg/mL条件下，测定不同温度下的酶活性，结果该酶水解淀粉的最适反应温度为50 ℃。随着温度的升高，酶蛋白开始变性，逐渐失去活性(见图3)。
3.5 金属离子对酶活力的影响
金属离子的存在对酶活性影响很大，有些金属离子是酶发挥催化活性所必需的，它们可作为辅酶或激活因子起作用。选择Zn2+、Ca2+、Fe2+、Mn2+4种常见的金属离子，分别测定不同浓度的溶液对鸡内金淀粉酶活性的影响。以不加任何离子的淀粉酶活性为对照，将对照组的酶活性设为100%，相对酶活力＝(添加无机离子组的酶活性/对照组酶活力)×100%。以相对酶活力对相应离子浓度作图，得图4～图7。
3.6 米氏常数的测定
以单位时间内OD值的单位变化来表示酶促反应的初速度，用双倒数法计算米氏常数。得线性回归方程为：Y=0.981 8X- 0.048 6，米氏常数为0.92 mg/mL。
3.7 鸡内金淀粉酶同工酶的检测
聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到一条鸡内金淀粉酶谱带，说明鸡内金中可能只存在一种性质的淀粉酶，没有同工酶，见图8。
4 讨论
国内外一些研究表明，无机离子对淀粉酶活性具有一定的影响，表现出激活或抑制的效应。李氏等[4]研究发现，在Mg2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Ca2+ 6种离子中，除Mg2+对淀粉酶有一定的激活作用外，其余5种离子均有抑制作用。其中Zn2+和Mn2+具有强烈的抑制作用，残余酶活力仅为对照的8.92%和4.86%，Cu2+和Fe2+残余酶活力分别为69.35%和76.27%；Ca2+对淀粉酶具有抑制作用，但抑制作用较小，残余酶活力为86.77%；Egas等[5]研究认为，Ca2+和Cu2+均抑制淀粉酶的活性；Martins等[6]的结果也表明，Ca2+抑制淀粉酶的活性；而梁氏等[7]利用植物材料研究时发现，0.5～5.0 mmol/L的Ca2+可增强水稻种子萌发时的α-淀粉酶活性。
无机离子对淀粉酶活性的影响机理很复杂，一般认为，无机离子是通过改变酶蛋白的构象来影响酶活性的。洪氏等[8]认为，低浓度重金属离子对淀粉酶的活性有激活作用，高浓度则严重抑制淀粉酶活性。在高浓度下，某些离子不仅可能完全占据Ca2+与淀粉酶的结合位点，而且还可能在Ca2+的结合位点以外的氨基酸残基上结合，从而导致酶的构象改变，使淀粉酶的活性发生改变。
本实验表明：Fe2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+ 4种离子对淀粉酶均有抑制作用，其中Ca2+的抑制作用最强，并且Ca2+浓度与淀粉酶相对酶活力有一定的线性相关性，Fe2+的抑制作用次之，Zn2+、Mn2+的抑制作用最弱。本实验的结果和前人的结果大致相同，只是关于Ca2+对淀粉酶的效应方面存在不一致。推测原因可能有两点：一是淀粉酶的来源不同，包括来自动植物和微生物，酶催化活性对金属离子的要求有差异。不同离子对淀粉酶的作用位点可能不同，有的离子对活性中心或调节中心具有影响，而有的离子可能对其它氨基酸残基产生影响；二是设定离子浓度的标准不同。本实验只是在单因素水平上研究了4种不同无机离子与淀粉酶活性的关系，离子之间的相互作用对淀粉酶活性的影响、同种离子对不同来源的淀粉酶活性的影响、无机离子对淀粉酶活性影响的机理等尚需进一步研究。
在不同的pH值条件下测定酶活力，pH 8.67时酶反应速度最快，当pH高于9时淀粉酶活性迅速下降。这可能是由于在高于pH 9和低于pH 8的反应体系中，酶蛋白构象发生改变而使催化能力丢失。使用淀粉作为底物，其分子量不均一，存在一个范围；并且，随着反应的进行，底物分子量发生变化，因此测定的Km值是一个初始值。
本实验采用区带电泳分离同工酶，虽然是最常用的分离同工酶的方法，采用高分辨率的支持物聚丙烯酰胺凝胶获得一条鸡内金淀粉酶谱带，但是能被电泳法分离的不一定是同工酶，酶带的数目也不一定能代表同工酶的数目。因为某些酶蛋白可与电泳介质中的带电物质相结合，改变其分子大小及电荷，从而改变电泳速度。因此不能仅凭一条酶带来判定鸡内金淀粉酶不存在同工酶，有可能是因为两种电泳速度不同的同工酶，其中一个和带电的小分子物质结合后，其电泳速度恰巧和另一个相等，从而在电泳时分离不开而只出现一条酶带。鸡内金淀粉酶是否存在同工酶还需要进一步鉴定。
【参考文献】
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