【摘要】 目的 观察通络宁心方对人脐静脉内皮细胞分泌作用的影响。方法 体外培养人脐带静脉内皮细胞；分别制备通络宁心方煎剂、复方丹参滴丸含药动物血清，随机分为正常组、模型组、治疗组(大、中、小剂量)、对照组(大、中、小剂量)8组。除正常组外，其余7组予h3O2造模，治疗组、对照组分别予大、中、小剂量含药血清，分别检测一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)、P-选择素(Ps)指标。结果 模型组NO含量显著低于正常组、治疗及对照大、中、小剂量组；模型组ET-1含量显著高于治疗及对照大、中、小剂量组；模型组Ps含量显著高于正常组，治疗中、小剂量组，对照大、中剂量组，与治疗大剂量、对照小剂量组比较，无显著性差异。结论 通络宁心方对血管内皮细胞分泌作用的影响与复方丹参滴丸有同一性，均能对抗h3O2对血管内皮细胞的损伤。
【关键词】 通络宁心方；人脐静脉内皮细胞；实验研究
Abstract：Objective To observe the protecting effect of Tongluoningxinfang decoction on human umbilical vein endothelial cells. Methods To cultivate endothelial cells and prepare serum with Tongluoningxinfang decoction and Fufangdanshenwan， cells were randomly separated into 8 groups， normal group， model group， treat group (high dose， medium dose， low dose)， control group (high dose， medium dose， low dose). Except normal group， add 30% h3O2 to the other groups， and make endothelial cells damaged models. Add serum with drugs to treat groups and control groups， and test NO， ET-1 and P-selection (Ps) respectively. Result NO of model group was significantly lower than normal group， all treat groups and all control groups. ET-1 of model group was significantly higher than all treat groups and all control groups. Ps of model group was significantly higher than normal group， treat groups (smedium dose， low dose) and control groups (high dose， medium dose). It had no significant difference compared with model group， treat group (high dose) and control group (low dose). Conclusion Tongluoningxinfang decoction has the same influence as Fufangdanshenwan on secretion of vein endothelial cells. Tongluoningxinfang decoction and Fufangdanshenwan all can prevent vein endothelial cells from damage induced by h3O2.
Key words：Tongluoningxinfang decoction；human umbilical vein endothelial cells；experimental research
不稳定性心绞痛(UA)是指介于稳定性心绞痛(SA)和急性心肌梗死(AMI)之间的一组临床心绞痛综合征，属于急性冠脉综合征(ACS)的表现形式。UA作为冠心病心绞痛的特殊类型，当属于中医学“胸痹”、“心痛”的范畴。血管内皮损伤被认为是动脉粥样硬化(AS)的始动因素。血管内皮功能紊乱所引起的继发性血管痉挛、血栓形成、斑块破裂在UA的发生、发展过程中占有重要地位。本课题组以温阳药为主配伍养阴药组成通络宁心方治疗UA，取得良好效果。本研究以过氧化氢(h3O2)所致体外人脐带静脉内皮细胞损伤模型为研究对象，通过检测一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)、P-选择素(Ps)来观察通络宁心方对血管内皮细胞分泌作用的影响，并以复方丹参滴丸作为阳性药对照，验证通络宁心方的作用机理。
1 实验材料
1.1 培养细胞
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)株(ECV-304细胞)，购自中国科学院典型培养物保藏委员会。
1.2 药物
通络宁心方由麻黄、附子、细辛、麦冬、玉竹等中药组成，所有药材均由盐城市中医院提供，并经南京中医药大学中药鉴定室鉴定，确定其科属符合实验用药要求。复方丹参滴丸，天津天士力制药股份有限公司生产。
1.3 主要试剂
RPMI-1640培养基(GIBCO，USA)、胰蛋白酶(Tprin，1﹕250，Amerso，USA)、小牛血清(杭州四季青)、30% h3O2(分析纯，镇江市化剂厂，批号2000109，临用时配成1 000 mmol/L的溶液，用孔径0.44 μm的滤膜过滤除菌备用)、NO试剂盒(南京聚力生物医学工程研究所)、ET放免药盒(中国人民解放军总医院科技开发中心放免所)、Ps试剂盒(南京聚力生物医学工程研究所)。
2 实验方法
2.1 动物含药血清的制备
日本大耳兔，体重1.8～2.5 kg，雌雄不拘，本校动物实验中心提供，合格证：苏动质97003。药物组分别给家兔灌胃相应药物(通终宁心方煎剂、复方丹参滴丸)，每天2次，连续灌胃4 d。于末次给药后1 h(灌药前禁食不禁水12 h)无菌条件下颈动脉取血，离心，分离血清，56 ℃、30 min灭活，0.45 μm的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于-20 ℃冰箱保存备用。
2.2 ECV-304的培养
将ECV-304接种于25 cm2玻璃培养瓶中，加15%的小牛血清的RPMI-1640培养基，置5%的CO2培养箱中37 ℃培养。每周用0.25%胰蛋白酶消化传代2～3次。将生长良好的ECV-304用0.25%的胰蛋白酶消化，轻轻吹打，制成细胞悬液，调整细胞浓度为5×106/mL，接种于6孔板中。待细胞长满后(约24 h)，弃去上清液。
2.3 造模及给药
将呈对数生长期的血管内皮细胞分为8组：正常组，模型组，大、中、小剂量治疗组，大、中、小剂量对照组。除正常组外，其余7组予 0.3 mL 30% h3O2造模；治疗组、对照组分别予0.6、0.3、0.15 mL相应的含药血清；8组均将加入0.3 mL小牛血清及适量的RPMI-1640液使各组总液体量达3 mL；上述操作完成后，置于37 ℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h。每隔6 h用倒置相差显微镜观察。24 h后，取各组培养液，置于-20 ℃冰箱中保存待测。
2.4 检测方法
NO的测定：取各组培养液，采用硝酸还原酶法测定NO。ET-1的测定：取各组培养液2 mL，注入含10%乙二胺四乙酸二钠30 μL和抑肽酶40 μL的试管中，混匀，4 ℃，3 000 r/min离心10 min，取上清，-70 ℃保存备用，采用放射免疫法测定ET含量。Ps的测定：取各组培养液，采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定Ps。具体测定方法均按照试剂盒说明进行。
2.5 统计学方法
所有数据均以x±s表示，并采用SPSS10.0统计软件进行各处理组间和区组间方差分析。
3 结果
(见表1)表1 通络宁心方对血管内皮细胞NO、ET-1分泌及Ps含量的影响(略)注：与模型组比较，*P&<0.05，**P&<0.01；与同剂量治疗组比较，△△P&<0.01。
4 讨论
目前研究证实，血管内皮是人体最大的具有分泌功能的组织之一，也是代谢组织的组分[1]。它能合成多种血管活性物质包括自分泌、旁分泌和内分泌性物质，从小分子气体的NO到肽类大分子ET-1与缓激肽等，对血管的舒缩功能与血液的流动性有不可代替的调节作用，对维持正常血液循环具有重要的生理意义。从以上NO、ET-1、Ps检测结果我们可以看出，通络宁心方对血管内皮细胞分泌作用的影响与复方丹参滴丸有同一性。Khadour等[2]研究也发现：在大鼠心肌中cNOS活性及其基因表达随年龄增加而明显增加，造成了心脏NO生成明显增加，引起心衰发作或加重原有心衰，提示过量的NO与心衰的发生有密切关系。此外，也有认为NO在体内既有保护作用，又有损伤作用，在离体培养的细胞中，则主要表现其细胞毒作用[3]。表１数据显示，模型组NO的释放明显多于治疗药物组及丹参滴丸对照组，而经药物干预以后，NO的分泌显著减少，意味着这种损伤可能的逆转，从另一角度则说明干预药物可能具有清除自由基、保护内皮或恢复内皮功能的作用。
但本实验对干预药物能够抑制过量NO产生的机制未作进一步探讨。我们也倾向于认为可能与抑制外源性h3O2刺激引起的iNOS的表达有关[4]。具体有待更深入的研究证实。
ET为一种由21个氨基酸组成的多肽，它的产生受许多激动剂的调控[5-6]。在生理情况下，ET-1可能作为自分泌从内皮细胞生成又作用于内皮细胞的ETB受体而舒张血管，这与它诱生NO及前列腺环素(PGI2)有关，而它如果作为旁分泌就近作用于其下的平滑肌细胞ETA受体，则可产生收缩血管的效应。另一方面ET的生物合成又受某些反馈机制的调节，比如NO就可以抑制ET-1的生成。这就不难解释为什么本实验干预组NO较之模型组释放减少，而ET-1其分泌却增加；这可能就是此种自身反馈调节机制作用的结果。
Ps属于细胞粘附分子的一个家族，又称颗粒膜蛋白GMP140或CD62p，是一种分子量为140的膜糖蛋白。h3O2是Ps表达的刺激剂，已有体外实验表明，h3O2能诱导人脐静脉内皮细胞的Ps从Weibel-Palade小体转位到细胞表面，但具体机理尚未明了。推测是氧自由基损伤内皮细胞，触发Weibel - Palade小体的内含物释放，Ps在内皮细胞表面表达增高[7]。我们也用h3O2造成内皮损伤模型，却发现与正常组相比，Ps的表达明显减少了。模型组其NO的生成和ET-1的分泌均明显减少，如何解释这一现象？我们认为这正是内皮细胞损伤的表现。因为h3O2本身是一种强氧化剂，可直接造成细胞损伤，推测：h3O2的存在使本实验模型组中有相当数量的细胞死亡或丧失分泌功能，而残存的细胞又不适当地分泌超过其生理调节量的NO，进一步参与或加强了内皮损伤的过程。因此相对于残存的具分泌功能的细胞数量而言，NO的释放显然是过多的，其结果是细胞毒效应。而由于细胞的分泌受到抑制，模型组中ET-1的含量也就减少了。前面我们曾推测外源性h3O2的刺激可能引起iNOS的表达，诱导产生过多的NO，导致细胞毒作用，而iNOS诱导产生的NO对Ps无抑制作用，因此，实际上相对于残存的具有分泌功能的细胞Ps也可呈过多表达。当实施药物干预后，可能挽救了大部分细胞，使具有分泌功能的细胞数目上调，而药物本身促ET-1的分泌，加上NO的反馈调节，就致使干预组中ET-1的分泌量显著增加。药物干预以后，Ps的表达又恢复接近于损伤前状态；无论是治疗组还是对照组，也无论含药血清的浓度有别，其结果都表现为治疗组、对照组Ps的释放浓度与正常组相比无显著性差异。也说明干预药物可能具有保护内皮或修复内皮功能的作用。
NO和ET-1均具有双重作用，并且作为一对维持血管张力、血流动力的平衡因子，在不同的疾病过程中，亦有不同的反应。因此，虽然ET-1分泌增加，NO合成降低通常被视为一种病理状态，但又不尽然，两者的平衡调节还涉及其他因素的参与。本实验如需进一步说明干预药物的抗氧自由基、抗AS的内皮保护作用，可能需引入其他高相关性指标。比如，用药前后SOD(超氧化物歧化酶)活性的测定等，以使实验结果更有利于问题的说明。我们的实验以体外培养内皮细胞为主，测定的是内皮细胞Weibel-Palade小体中Ps的表达，反映的是动脉粥样硬化早期的炎症反应状况，但对血小板α颗粒内Ps的膜表达无法予以观测，如果能通过整体实验既观察Ps的表达，同时又对参与血栓状态的其他因素，如D-二聚体、纤维蛋白原等进行监测，可能更有助于全面认识UA的发生及治疗药物的干预机制。
参考文献
[1] Tiziana B， Lucia M. Endothelia cell inculture：a model for studying vascular function[J].Paramacological research，2000， 42(1)：111－121.
[2] Khadour FH， Kao RH， Park S， et al. Age-dependent augmentation of cardiac endotheil NOS in a genetic rat model of heart failure[J].Am J Physiol，1997，273：H1223－1233.
[3] 孙宏霞.亚低温对大鼠局灶性脑缺血自由基和NO的影响[J].中国实验诊断学，2004，8(6)：643.
[4] 蒋 莉.丹参素对内毒素性肝损伤的防护作用及其机制研究[J].西医结合">中西医结合肝病杂志，1999，9(2)：30.
[5] Janakidevi K， Fisher MA， del Vecchio PJ， et al. Endothelin-1 stimulates DNA synthesis and proliferation of pulmonary artery soomth muscle cells[J].Am J Physiol，1993，263(32)：1295.
[6] Saijonmaa O， Nyman T， Fyhrquist F. Endothelin-1 stimulates its own synthesis in human endothelial cells[J]. Biochem Biophy Res Commun，1992，88：286.
[7] Niu XF， Smith CW， Kubes P. Intracelluar oxidative stress induced by nitric synthesis inhibition increases endothelial cell adhesion to neutrophil[J].Cir Res，1994，74(6)：1133－1140.