作者：徐瑞荣，王琰，安玉姬，于志峰，戴锡孟
【摘要】 目的 通过观察补肾益髓中药对慢性再生障碍性贫血患者造血调控因子表达的影响，探讨补肾中药的调节机制。方法 将120例患者随机分为补肾益髓法治疗组90例，西药对照组30例；另取志愿献髓者骨髓10例作为正常健康人对照组。通过RT-PCR法观察其骨髓造血细胞调控因子干细胞因子(SCF)、白细胞介素3(IL-3)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)mRNA的半定量表达情况。结果 两组患者治疗前SCF、IL-3表达水平明显低于健康人组(P&<0.01)，治疗后升高(P&<0.05)，治疗组高于对照组；治疗前TNF-α、IFN-γ表达水平明显高于健康人组(P&<0.01)，治疗后降低(治疗组P&<0.01，对照组P&<0.05)，治疗组低于对照组(TNF-αP&<0.01，IFN-γP&<0.05)。结论 补肾益髓法中药可调节紊乱的免疫状态，增强正调控因子的作用，解除过高的负调控因子对造血细胞的过度抑制而达到治疗目的。
【关键词】 慢性再生障碍性贫血；补肾益髓法；造血调控；细胞因子
Abstract：Objective To observe the effect of chronic aplastic anemia patients treated with promoting kidney and tonifing bone herbs on the expression of hematopoiesis regulation factors， and discuss the mechanism of kidney-promoting herbs. Methods 120 cases of chronic aplastic anemia were randomly pided into two groups， 90 cases treated with promote kidney and tonify bone method ， and 30 cases treated with western medicine. Besides these， 10 cases of volunteers’ bone marrow were collected as normal control. Hematopoiesis regulation factors such as SCF， IL-3， TNF-α and IFN-γmRNA semi-quantitative expression were observed by RT-PCR. Results The expression level of SCF and IL-3 mRNA in two groups was lower obviously than normal control (P&<0.01) before treatment， and increased after treatment (P&<0.05). The level of the herbs group was higher than control group after treatment. The expression level of TNF-α and IFN-γmRNA in two groups was higher markedly than normal control (P&<0.01) before treatment， and decreased after treatment (herbs group P&<0.01， control group P&<0.05). The level of treatment group was lower than control group after treatment (TNF-α P&<0.01， IFN-γ P&<0.05). Conclusion Promoting kidney and tonifing bone herbs can regulate the disorder of immunity， boost the effect of positive hematopoiesis regulation factors， and relieve the arrest of negative ones， then achieve anticipated response.
Key words：chronic aplastic anemia；promoting kidney and tonifing bone method；hematopoiesis regulation；cytokine
再生障碍性贫血(简称“再障”)是血液系统常见的疾病。现代医学认为其发病机制主要与造血干细胞的异常、造血微环境损伤及造血调控因子分泌异常有关，其中造血调控因子介导的免疫机制紊乱可能是其重要的发病机制之一。中医学认为，其基本病机在于肾精亏虚。国内将再障分为急性和慢性两类。我们用补肾益髓法为主治疗慢性再障，通过RT-PCR法观察补肾益髓中药对慢性再障肾虚患者造血调控因子白细胞介素3(IL-3)、骨髓造血细胞调控因子干细胞因子(SCF)、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)调节作用，现报道如下。
1 临床资料
所有病例均符合张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》[1]中慢性再障的诊断标准。治疗慢性再障患者总计120例，其中男性65例，女性55例，年龄11～74岁。按随机数字表法分为补肾益髓法治疗组90例，西药对照组30例。两组资料治疗前差异无统计学意义(P&>0.05)。另取志愿献髓者骨髓10例作为正常健康人对照组。
2 方法
2.1 治疗方法
两组慢性再障患者均停用其他治疗再障的药物2周后进行观察。治疗组给予补肾益髓方药服用(鹿角胶、党参、当归、白术、茯苓、生黄芪、菟丝子、淫羊藿、巴戟天、补骨脂、女贞子、墨旱莲、生地黄、枸杞子、黄精、阿胶、龟甲胶、何首乌、山茱萸、地骨皮等)，水煎服，每日1剂，连用6个月。加减：出血倾向明显者加牡丹皮、侧柏叶、三七粉(冲服)；发热、感染明显者加金银花、连翘、栀子、黄芩、板蓝根。对照组给予康力龙2～4 mg，每日3次，口服，连续使用6个月。2组患者治疗期间，均配合对症支持治疗：如合并细菌感染者及时应用抗生素控制感染；血红蛋白低于45 g/L、临床贫血症状明显者给予间断输血；出血严重者给予止血药或输注浓集血小板。
2.2 检测方法
收集各组患者治疗前后的骨髓单个核细胞(BMMNC)。另取志愿献髓者骨髓10例作为正常健康人对照。通过RT-PCR法观察其骨髓造血细胞生长因子IL-3、SCF和造血负调控因子TNF-α、IFN-γ的mRNA半定量表达情况。
2.2.1 骨髓标本制备及总RNA提取
常规无菌采集骨髓5 mL， EDTA抗凝。经淋巴细胞分离液梯度离心分离BMMNC，1 500 r/min， 25 min；RPMI1640液洗涤2次，1 500 r/min，5 min；弃1640液，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为
2×106/mL，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养；隔夜后换液，并加入终浓度为5 ng/mL的植物血凝素(PHA)，继续培养72 h，离心弃上清，留BMMNC用Trizol提取总RNA，得到的RNA溶液于-70℃冰箱保存待用。
2.2.2 RT-PCR反应(逆转录-聚合酶链反应)
用宝生物公司RT-PCR一步法试剂盒检测。具体步骤见说明书。特异性RT-PCR基因引物：Human actin beta上游5'-AGCGAGCATC CCCCAAAGTT-3'，下游5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'。IL-3上游5'-GCTCCCATGACCCAGACAACGTCC-3'，下游5'-CAGATAG AACGTCAGTTTCCTCCG-3'。SCF上游5'-CTCCTATTTAATCCTCT CGTC-3'，下游5'-TACTACCATCTCGCTTATCCA-3'。TNF-α上游5'-CAGAGGGAAGAGTTCCCCAG-3'，下游5'-TTGACCTTGGTCTGG TAGGAG-3'。IFN-γ上游5'-ATGAAATATACAAGTTATATCTT GGCTTT-3'，下游5'-GATGCTCTTCGACCTCGAAACAGCAT-3'。经RT反应、RTase失活、变性、退火、延伸等条件反应后，所得反应液进行琼脂糖凝胶电泳、mRNA半定量检测。
转贴于2.3 统计学方法
计量资料采用单因素方差分析及t检验，均以x±s表示。
3 结果
(见表1)表1 治疗前后BMMNC mRNA的半定量表达情况(略)注：与治疗前比较，*P&<0.05，**P&<0.01；与健康人组比较，△△P&<0.01；与对照组治疗后比较，▲P&<0.05，▲▲P&<0.01。
由表1可知，2组治疗前BMMNC mRNA的半定量表达IL-3、SCF水平均明显低于健康人组(P&<0.01)；治疗后BMMNC体外诱生IL-3、SCF水平升高，与治疗前相比均有显著性差异(P&<0.05)。治疗后治疗组BMMNC mRNA的半定量表达IL-3、SCF水平高于对照组，但无统计学意义；治疗后BMMNC mRNA的半定量表达IL-3、SCF水平与健康人组相比仍有非常显著性差异(P&<0.01)。
2组治疗前BMMNC mRNA的半定量表达TNF-α、IFN-γ水平明显高于健康人组(P&<0.01)；治疗后与治疗前相比均有显著性差异(治疗组P&<0.01，对照组P&<0.05)；治疗后治疗组BMMNC mRNA的半定量表达TNF-α、IFN-γ水平与对照组相比有显著性差异(TNF-αP&<0.01，IFN-γP&<0.05)；治疗后BMMNC mRNA的半定量表达TNF-α、IFN-γ水平与健康人组相比仍有非常显著性差异(P&<0.01)。
4 讨论
随着对正常造血调控的认识，越来越多的学者提出，外周血及骨髓T细胞克隆性增生式淋巴细胞亚群功能异常及多种与造血有关的正负调控因子分泌异常，在再障的发生、发展及临床转归中起着重要作用。
IL-3是多克隆造血生长因子，是免疫系统调节造血系统的主要成分，主要作用于早、中期造血祖细胞的增殖和分化，可刺激多种骨髓细胞生长和分化[2]。有研究发现，再障患者体内IL-3水平较正常人低下[3]。本实验证实，慢性再障患者治疗前IL-3分泌水平较正常人低，经补肾益髓中药治疗后，IL-3分泌水平有明显提高，说明补肾益髓中药可能作用于造血干细胞或多能性前阶段细胞，通过促使他们增殖分化，从而促进早期造血干细胞的增殖、发育。SCF又称肥大细胞生长因子(MGF)，它所作用的靶细胞是极早期的、具有多向分化潜能的造血干细胞，如CD34+、Lin+等，促使这类细胞由静止的、休眠状态进入细胞周期或加快细胞周期的进程。本实验发现，慢性再障患者治疗前SCF分泌水平较正常人低下，经补肾益髓中药治疗后，SCF分泌水平有明显提高。由于SCF本身不刺激集落的生成，但与其它生长因子(GM-CSF、G-CSF、EPO，IL-1、3、5、6、7、9等)有较好的协同作用，提示补肾益髓中药通过刺激SCF的分泌，与GM-CSF、EPO、IL-3协同作用，从而能促进多系造血细胞的增殖与分化，生成各种定向祖细胞集落。
IFN-γ主要由活化T细胞、NK细胞产生。TNF-α又称恶质素，是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，它是再障中引起骨髓抑制的主要抑制因子。有研究证实，部分再障患者血清及骨髓上清IFN-γ、TNF-α水平升高，外周血单个核细胞分泌IFN-γ、TNF-α功能增强[4]。我们在实验中发现，慢性再障患者BMMNC体外诱生IFN-γ、TNF-α水平较正常人明显升高。经补肾益髓中药治疗后，IFN-γ、TNF-α的分泌水平显著降低，其作用机制可能与调节机体的免疫功能密切相关，通过改善再障患者紊乱的免疫状态，减轻慢性再障患者骨髓抑制情况，从而使造血细胞增殖、分化功能在一定程度上得以恢复。
参考文献
[1] 张之南.血液病诊断及疗效标准[M].第2版.北京：科学出版社， 1998.34－39.
[2] Encabo A， Solves P， Mateu E， et al. Selective generation of different dendritic cell precursors from CD34+ cells by interleukin-6 and interleukin-3[J].Stem Cells，2004，22(5)：725－ 740.
[3] 马付坚.再生障碍性贫血患者细胞因子检测及其临床意义[J].广西医学，2004，26(3)：330－331.
[4] 徐淑芬，白 海，王存邦，等.再生障碍性贫血患者对环胞菌素A治疗的反应与骨髓上清TNF-α、IFN-γ水平的关系[J].中国现代医学杂志， 2005，15(4)：486－489.