中药联合褪黑激素对帕金森模型大鼠前脑纹状体细胞凋亡和行为学的影响

　　　　作者：严丽荣 周亚平 苗曼悌 王林仙 徐金 张晔 周志强 刘益仁 狄荣科

【摘要】 目的 观察中药(平颤方)联合褪黑激素（MT）对帕金森病(PD)模型大鼠行为学和前脑纹状体细胞凋亡的影响，探讨中药联合MT治疗PD的作用及其机制。 方法 SD大鼠60只，分5个组：空白对照组、模型对照组、MT组、中药组、中药+MT组。模型对照组和各治疗组大鼠腹腔注射N甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶（MPTP）建立PD模型，用爬杆法和迷宫试验测量大鼠行为学改变和智力状况，Bax/Bcl2免疫组织化学染色和Tunel法检测前脑纹状体凋亡细胞。 结果 PD大鼠出现不同程度爬杆能力下降和智力减退；与病理对照组相比，用药实验组尤其是中药+MT组大鼠行为学异常可部分或全部改善（P＜0.05），前脑纹状体神经元和胶质细胞Bcl2蛋白表达明显增强（P＜0.01），Bax基因表达受抑制（P＜0.01），同时前脑黑质纹状体通路细胞凋亡减少（P＜0.01）。结论 中药平颤方联合MT通过抗氧化应激途径，激活Bax/Bcl2系统，调节前脑黑质纹状体通路多巴胺（DA）神经活性，抑制细胞凋亡和改善PD症状。

【关键词】 中药平颤方；褪黑激素；N甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶；细胞凋亡；帕金森病

帕金森病(PD)在中医学中属于“颤证、颤振”范畴，中老年人肝肾亏虚，髓海不足，虚风内动是本病发病之源〔1〕。临床应用左旋多巴替代内源性多巴胺(DA)的缺乏，可改善PD症状，但大多数病人服药一段时间后疗效减退，出现运动障碍、智力减退和精神症状等副作用。根据中医对PD的认识并结合临床经验拟定中药平颤方，观察中药联合褪黑激素（MT）对前脑纹状体细胞凋亡的影响及功能的改善，探讨其联合治疗PD的作用及机制。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象

　　雄性SD大鼠，体重255～305 g（鼠龄6～8 w），由江苏大学医学院实验动物中心提供。动物自由进食饮水，光照12/12 h明暗交替，室温饲养。用爬杆法进行筛选：引导动物在10 s内自杆顶爬至杆底，每只训练4次，训练完毕对其进行测定，选取正常（0分）大鼠进入实验，随机抽取12只作空白对照组，其余作建模处理。将MPTP用生理盐水配制，浓度为30 mg/ml，30 mg/kg腹腔注射，每日1次，共7 d。再用爬杆法进行筛选，筛选48 只PD模型(1.5～2.0分)大鼠进入实验；随机抽取36只作为治疗组（中药组、MT组、中药组+MT组，每组12只），其余12只作模型对照组。总共入选大鼠60只，每组均为12号。

　　1.2 方法

　　各治疗组和模型对照组大鼠于末次注射MPTP及用药/水后7、14、21 d，进行爬杆试验，每只大鼠允许爬杆3次，计算平均分。爬杆实验用直径35 mm、高1 000 mm的光滑不锈钢管，垂直竖立，将大鼠头向下放置在金属杆的顶部，使其沿杆自然爬下，观察动物在下行过程中的行为，并按标准计分，评分标准如下：四肢并用，一次顺利从杆上爬下为0分；一步一步螺旋向下爬行但兼有后肢滑行行为的为0.5分；上杆后间歇停顿数次后爬下，但可抱紧金属杆为1分；滑行后掉落为1.5分；不能抓杆，直接掉落为2.0分。同时对所有动物进行“T”形迷宫实验，测定动物智力状况，每只大鼠走迷宫3次，计算平均错误次数。

　　1.2.1 中药配方及治疗

　　中药平颤方由黄芪、天麻、银杏叶、白芍、钩藤、连翘、生甘草、野生葛根、大叶红景天、黄连等组成，制成浓缩煎剂。每日20:00胃饲中药除平颤方煎剂3 ml（相当于中药10 g），同时腹腔注射MT 10 mg/kg，连续治疗21 d；模型对照组，每日同时胃饲3 ml生理盐水和腹腔注射1 ml生理盐水。MT（Sigma公司产品）使用前先用无水乙醇溶解，然后加生理盐水稀释，MT初始浓度为3 mg/L，使用前调至所需终浓度，其中无水乙醇浓度小于0.5％(V/V)。

　　1.2.2 取材和切片制备

　　各组动物分别于末次注射MPTP后用药/生理盐水治疗7、14、21 d，用10%水合氯醛麻醉，0.9%生理盐水150 ml经心脏快速灌注冲洗，再用4.0%多聚甲醛200 ml灌注。取右侧半脑，10%甲醛固定48 h以上。以松果体为标志，向头侧横向切取3段，每段厚2 mm，前段为纹状体最大分布区。石蜡包埋，连续切片，片厚5 μm，取4套切片，分别用于HE染色，Bax/Bcl2免疫组织化学染色和Tunel法细胞凋亡染色。

　　1.2.3 Bax/Bcl2免疫组织化学染色

　　采用SP法，兔抗鼠Bax、Bcl2抗体及生物素羊抗兔IgG（购于武汉博士德生物技术公司）。切片脱蜡后，用3%甲醇过氧化氢孵育20 min，将切片置于10%牛血清蛋白30 min，分别在切片上加入Bax、Bcl2（1∶200）抗体，在温箱内过夜。次日加生物素IgG（1∶100）37℃反应30 min。用0.01 mmol/L PBS（pH7.4）充分洗涤，DBS/h3O2显色，常规脱水，透明和封固。

　　1.2.4 Tunel法细胞凋亡染色

　　将切片脱蜡水合，蛋白酶K（20 mg/L）室温下消化30 min，正常小牛血清37℃孵育1 h，加入Tunel混合反应液，37℃温箱反应2 h，3% h3O2封闭15 min，加入POD转移液，温盒内37.0℃温箱孵育1 h，加DAS显色3～5 min，苏木素复染，常规脱水，透明和封固，光镜观察。各组连续切片，相同层面选取3张切片，每张切选取3个视野，用CMIAS 98彩色病理图像分析系统进行分析。

　　1.3 统计学分析

　　数据以x±s表示，组间比较用单因素方差分析，两两比较用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 治疗对PD大鼠行为的影响

　　注射MPTP后60 min，大鼠协调能力开始降低，下滑加快，甚至不能抱杆、坠落。 持续注射MPTP 7 d，爬杆实验测定，选择1.5～2.0分大鼠为病理对照组和用药实验组。造模后治疗组协调能力逐渐恢复，症状改善。治疗7、14、21 d爬杆实验与模型对照组相比各治疗组行为恢复明显。见表1。。表1 大鼠爬杆实验测定（略)

　　2.2 治疗对PD大鼠智力状况的影响

　　模型大鼠出现不同程度的行为智力和运动障碍，表现为动作迟缓、震颤、竖毛，对外界刺激反应低下。用药治疗后症状改善或消失。应用“T”型迷宫试验测定智力，错误次数减少；随着治疗时间延长，动物智力恢复明显。见表2。表2 大鼠迷宫试验智力测定（略)

　　2.3 治疗对PD大鼠前脑细胞的影响

　　光镜观察可见，模型对照组大鼠脑组织高度水肿，少量神经细胞和胶质细胞溶解、消失，组织结构紊乱、疏松，少量炎性细胞浸润；残存神经细胞皱缩、中央尼氏体溶解消失、核轮廓不清；神经胶质细胞呈核固缩或裂解；神经纤维水肿增粗，呈波浪形改变。用药组和空白对照组大鼠脑组织未见上述病理改变，纹状体区Bax、Bcl2、Tunel染色阳性细胞呈单个散在或小群细胞分布，阳性部位在胞核和胞浆。Bax基因蛋白于模型对照组表达最高，用药组次之，空白对照组最低；Bcl2基因蛋白于用药组呈高表达，空白对照组次之，模型对照组表达最低；与之相应，Tunel阳性细胞以模型对照组最高，用药组次之，空白对照组最低。三个用药模型组间比较，Bax以中药+MT组最低，Bcl2以中药+MT组最高，Tunel染色阳性细胞以中药+MT组最低，见表3，图1表3 PD大鼠前脑Bax、Bcl2、Tunnel染色阳性细胞（略)

　　3 讨 论

　　中药可以有效地延缓和阻止DA能神经元的变性、凋亡，并提高前脑DA的含量，从而延缓病程和减轻病症〔1，2〕。孙红梅等〔3〕 的实验也证实银杏平颤方及其拆方可通过阻止线粒体酶复合体活性的下降，从而保护线粒体的功能，防止DA神经元的凋亡，减缓PD病程的进展。近年来对MT药理作用的研究越来越多，尤其是其抗氧化及清除自由基的作用受到重视〔4〕。另文报道〔5〕 ，MPTP复制PD动物模型，前脑组织DA、高香草酸(HVA)、二羟基苯乙酸(DOPAC)含量均较空白对照组显著降低，同时伴随智力减退和运动障碍。

　　本文结果显示，给予中药平颤方联合MT治疗PD，大鼠前脑纹状体神经元和胶质细胞Bcl2基因蛋白的表达明显增多增强，Bax基因表达则反。随之，DA细胞凋亡减少。Bcl2基因作为广义的抗凋亡基因的激活剂，可能途径是抑制细胞内Ca2+超载，减少并抑制脂质过氧化物对神经细胞的毒性作用，从而调节细胞凋亡基因〔6～8〕。因此，在PD早期采取积极措施，促进Bcl2基因蛋白的表达，抑制Bax基因蛋白的表达，调节细胞凋亡发生的早期环节，阻断病理生理变化向恶性方向发展，以减轻或消除DA氧化应激引发的神经系统损伤。
　　
　　平颤方中黄芪可扶正补气，现代药理学研究其有调节免疫，抗衰老，抗应激等作用，天麻、钩藤有平肝息风、能镇静、抗惊厥等作用，金银花具有清热解毒、凉风散热，黄连可清热燥湿，白芍可养血柔肝、补益肝肾，银杏叶、红景天和野生葛根则可活血化瘀、疏通经络，均可增加脑血流量，改善神经系统症状。甘草益脾和胃协调诸药。MT由于具有高弥散穿透能力，可在细胞膜、胞质、胞核等不同部位发挥作用，抗氧化作用具有广泛性和复合性的特点，经提高脑的抗氧化能力，防止脑组织免受自身氧化应激损伤〔9〕。二者联合使用，重视辨证论治的统一性和证候之间的有机联系，探索中医或西医结合">中西医结合治疗PD的优势及其作用机制。

参考文献

　1 李种泰，杨文波.滋补肝肾填精益髓法治疗帕金森病临床观察〔J〕.时珍国医国药，2006；17（2）：2589.

　　2 Hayley S，Crocker SJ，Smith PD，et al.Regulation of dopaminergic loss by Fas in a 1methyl4 phenyl 1，2，3，6tetrahydropyridine model of Parkinson′s disease〔J〕.J Neurosci，2004；24(18):204553.

　　3 孙红梅，白丽敏，张 军，等.银杏平颤方及其拆方对帕金森病模型小鼠脑内线粒体酶复合体活性的影响〔J〕.中国中西医结合杂志，2005；25(11):10081.

　　4 Antolin I，Mayo JC，Sainz RM，et al.Protective effect of melatonin in a chronic experimental model of Parkinson′s disease〔J〕.Brain Res，2002；943（2）:16373.

　　5 Bordet R，Devos D，Brique S，et al.Study of circadian melatonin secretion pattern at different stages of Parkinson′s disease〔J〕.Clin Neuropharm acol，2003；26（2）:6572.

　　6 Medeiros CA，Carvalhedo de Bruin PF，Lopes LA，et al.Effect of exogenous melatonin on sleep and motor dysfunction in Parkinson′s disease.A randomized，double blind，placebocontrolled study〔J〕.J Neurol，2007；254(4):45964.

　　7 Sharma R，McMillan CR，Tenn CC，et al.Physiological neuroprotection by melatonin in a 6hydroxydopamine model of Parkinson′s disease〔J〕.Brain Res，2006；1068(1):2306.

　　8 Alvira D，Tajes M，Verdaguer E，et al.Inhibition of the cdk5/p25 fragment formation may explain the antiapoptotic effects of melatonin in an experimental model of Parkinson′s disease〔J〕.J Pineal Res，2006；40(3):2518.

　　9 王本祥.现代中药药理学〔M〕.天津：天津科学技术出版社，1996：6005；71335;80911.