腺苷预适应对心肌的延迟保护研究

　　　　 作者：丁家望 杨俊 李松 李稳慧 李莉 姜玉蓉 陈勇

【摘要】 目的 旨在证实ATP敏感性钾通道（KATP）的开放和内源性一氧化氮合成酶（iNOS）表达上调介导了腺苷(ADO)预处理的延迟保护。方法 实验动物随机分成4组，对照组：心肌缺血前24 h静注生理盐水；ADOA1受体激动剂（CCPA）组：心肌缺血前24 h静注CCPA进行药物预处理；格列苯脲（Gli）组：心肌缺血前30 min静注Gli；CCPA/Gli组：在CCPA组处理的基础上，心肌缺血前30 min静注Gli。采用家兔离体工作心脏模型，各组心肌均缺血30 min，复灌30 min。观察缺血/再灌注前后血流动力学和心功能变化。测定再灌注后冠脉流出液乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CPK）、一氧化氮(NO)和心肌组织三磷酸腺苷（ATP）含量。用氯化三苯基四氮唑(TTC)判断心肌梗死范围。逆转录酶链聚合法测定iNOSmRNA。结果 ①CCPA预处理明显改善心肌缺血/再灌注后心功能的恢复，且这种保护作用被Gli阻断；②CCPA预处理减少心肌缺血/再灌注后冠脉流出液LDH、CPK含量，且Gli可抑制这种保护效应；③CCPA预处理可缩小心肌梗死范围，且被Gli阻断；④CCPA预处理可增加心肌组织ATP浓度，Gli可拮抗这种保护作用；⑤CCPA预处理轻度提高心肌组织NO浓度，此效应不受Gli影响；⑥CCPA预处理上调心肌组织iNOS表达，此效应不受Gli拮抗。结论 iNOS合成的NO通过激活KATP介导ADO预处理的延迟保护效应。

【关键词】 腺苷受体；再灌注损伤；延迟保护

心肌短暂缺血后不仅具有即刻的保护作用，同时具有延迟保护〔1〕。腺苷(ADO)及其受体参与了预处理的早期保护作用，同时也是延迟保护的重要介质〔2〕。KATP阻滞剂5羟基癸酸(5hydroxydecanoate，5HD)可以拮抗ADO预处理带来的心肌保护作用〔3〕。KATP是单磷酰脂A(MLA)预处理诱导心肌延迟保护的主要内在机制。本文拟利用外源性ADO A1受体激动剂预处理家兔以模拟缺血预处理的心肌延迟保护效应，探讨ADO预处理心肌延迟保护的受体后机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要材料与试剂

　　清洁级家兔48只，体重2.5～3.5 kg，雌雄不限。ADOA1激动剂2氯6氮环戊烷基ADO(CCPA) (美国Simga公司)；Trizol RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)；RTPCR按照试剂盒(日本TaKaRa公司)；PCR引物购自Promega公司；其他试剂均为国产分析纯。Newport全自动呼吸机和心输出量检测仪，美国；低温离心机Biofuge22R，德国Heraeus公司；超速离心机，Beckman公司；LKB1251生物发光仪和可见紫外分光光度计，上海分析仪器厂。

　　1.2 动物模型

　　耳缘静脉注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)将兔麻醉后，用肝素500 U/kg抗凝。迅速开胸取出心脏置入改良KrebsHenselert液中，行主动脉和左心房插管，置于灌注架上，以95%O2和5%CO2饱和的KrebsHenselert液经主动脉行Langendorff逆行灌注，温度37℃，灌注压10 kPa。经左心室壁插入压力探头，经压力换能器连接于多道生理记录仪。 Langendorff灌注10 min 后转为工作心状态，即经左房灌注(压力为1.995 kPa)。平衡灌注15 min后，钳闭左心房插管造成全心缺血30 min，然后恢复灌注30 min。灌注完毕，心脏以及再灌注30 min时冠脉流出液标本置-70℃保存。

　　1.3 实验分组

　　实验动物随机分为4组：对照组(n=12)：心肌缺血/再灌注24 h前静注生理盐水0.5 ml作为对照；(2)CCPA组(n=12)：心肌缺血/再灌注24 h前静注CCPA(0.1 mg/kg)作为药物预处理；Gli组(n=12)：心肌缺血/再灌注开始前30 min静注Gli(0.3 mg/kg)；CCPA/Gli组(n=12)：CCPA预处理(同第二组)的基础上，在心肌缺血/再灌注开始前30 min静注Gli(0.3 mg/kg)。灌注结束后，各组取6只家兔用于心肌梗死范围测定，另6只用于其他观察指标的测定。各组于平衡灌注15 min时测定血流动力学指标作为基础值，测定再灌注末相关指标为实验值。

　　1.4 观察指标

　　1.4.1 血流动力学参数测定

　　心脏跳动稳定后，记录心率(HR)、冠脉流量(CF)、心输出量(CO)、左心室舒张期末压(LVEDP)、左心室收缩期峰压(LVSP)。以停灌前工作心功能基础水平为100%，比较复灌末心功能恢复的百分率。

　　1.4.2 心肌梗死范围测定

　　灌注结束后，从左心室导管推注2%～3%Evans蓝2～3 ml，2 min后迅速取下心脏，分离缺血区(无蓝色)和非缺血区(蓝色)，将缺血心肌以滤纸吸干，置于天平上称重。再将缺血区水平切成5～6片，每片厚1～2 mm，置入1%TTC磷酸缓冲液(pH7.4)中37℃水浴10～15 min。缺血危险区因脱氢酶还原TTC 而呈红色，梗死区因脱氢酶流失而呈白色，将梗死区和非梗死区分离并分别称重，梗死范围以梗死心肌占缺血心肌重量的百分比表示。

　　1.4.3 心肌组织超微病理分析

　　灌注结束后，从心尖部缺血中心边缘区切取1 mm3全层心肌组织数块，放入0.1 mol/L的磷酸戊二醛溶液内(pH7.4)固定，1%锇酸后固定，按电镜要求逐级酒精脱水、EPON812定向包埋、LKBV型超薄切片机切片。醋酸双氧铀及柠檬酸双重染色，用OPTON EM10C型透射电子显微镜观察心肌超微结构并摄片。

　　1.4.4 心肌损伤指标

　　收集复灌后30 min的心脏冠脉流出液，取标本2 ml，冷冻储存，24 h内送检。使用全自动生化分析仪测定肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)浓度，计算30 min的心肌CK和LDH漏出率，CK(LDH)漏出率=CK(LDH)(U/L)×30 min流出液(L) /心肌总湿重(g)。

　　1.4.5 心肌组织ATP含量

　　灌注结束后取左心室心尖部全层心肌组织100 mg，吸干水渍后迅速置入液氮内保存。测定时称重，心肌组织加0.3 mol/L高氯酸0.5 ml冰浴下制成心肌匀浆，吸出组织液置入离心管中，再加0.3 mol/L高氯酸1.5 ml仔细冲洗匀浆器，将此冲洗液加入离心管中，于低温离心机内离心5 min(4 000 r/min)后提取上清倾入另一干净离心管中。用0.5 mol/L KOH调pH至7.6～7.8，再次离心提取上清，在6 h内用荧光素酶法在LKB1251生物发光仪上测定ATP浓度。

　　1.4.6 冠脉流出液中NO含量的测定

　　按Griess法测定NO，①取三支试管，空白管加去离子水0.4 ml和Griess试剂A 0.4 ml，测定管加样品0.4 ml和Griess试剂A 0.4 ml，标准管加标准应用液0.4 ml和Griess试剂A 0.4 ml，混匀，室温放置5 min后分别加Griess试剂B 0.4 ml。②混匀，室温放置5 min，选择波长546 nm，空白管调零比色，读取吸光度值。③结果计算：样品NO-2浓度(μmol/L)=测定管吸光度/样品管吸光度×2.5。

　　1.4.7 iNOS mRNA检测

　　用Trizol RNA提取试剂盒对保存在液氮中的心肌组织总RNA进行抽提与纯化，然后逆转录为cDNA。RTPCR按照试剂盒说明书进行操作，采用50 μl反应体系。反应条件：94℃变性4 min；94℃ 30 s，50℃ 40 s，72℃ 40 s，循环35次；最后72℃延伸7 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶自动成像系统上摄像并分析各条带吸光度值(基因表达值=目的基因/内参照)。本实验设定βactin为内参照。iNOS基因引物序列如下：正义链5′AGCATCACCCCTGTGTTCCACCC3′；反义链5′TGGGGCAGTCTCCATTGCCA3′，扩增片段为218 bp。βactin的引物序列如下：正义链5′GAGCACCCCGTGCTGCTCACCCTAGG3′，反义链5′GTGGTGGTGAAGCTGTAGCCACGCT3′，扩增片段为160 bp。

　　1.5 统计学分析

　　数据以x±s表示，非正态分布数据先行对数处理，用SAS软件包做ANOVA及q检验。

　　2 结 果

　　2.1 血流动力学

　　CCPA组家兔HR、CF恢复率与对照组比较无统计学差异(both P＞0.05)，而CO、LVSP和LVEDP的恢复明显好于对照组(P＜0.01)，提示ADOA1激动剂CCPA预处理能促进家兔心脏缺血/再灌注后心脏收缩和舒张功能的恢复。CCPA/Gli组家兔心功能恢复明显不及CCPA组(P＜0.01)，与对照组比较无显著差异(P＞0.05)，而单用Gli组心功能恢复与对照组比较也无显著差异(P＞0.05)，说明Gli本身不影响缺血/再灌注后的心功能恢复，但其可抑制CCPA对心脏收缩、舒张功能的保护。见表1。表1 各组家兔灌注末血液动力学恢复率(略)

　　2.2 心肌梗死范围

　　CCPA预处理组家兔心肌梗死范围明显＜对照组(13.4%±2.3%vs 32.1%±4.5%，P＜0.01)，提示CCPA预处理可限制因缺血/再灌注引起的心肌梗死。CCPA/Gli组家兔心肌梗死范围＞CCPA组(30.2%±4.9%，P＜0.01)，与对照组无显著差异(P＜0.01)，而单用Gli组与对照组比较也无显著差异(34.7%±5.4%，P＞0.05)，说明Gli本身不影响家兔心脏的心肌梗死，但可抑制CCPA限制心肌梗死的范围。

　　2.3 心肌细胞超微结构的改变

　　正常心肌组织电镜下心肌肌原纤维排列整齐，肌丝清晰；线粒体结构完整，无肿胀和空泡样变性；线粒体间糖原颗粒丰富；细胞核和核仁显示良好，呈黑色。对照组心肌组织肌原纤维排列紊乱，肌丝溶解消失，肌浆网扩张；线粒体肿大、嵴断裂、溶解和空泡样变性；线粒体间糖原颗粒少；细胞核异形变、染色质边集、核内空泡样变和核膜模糊。CCPA组家兔心肌细胞的超微结构改变的损伤较轻。见图1。

　　2.4 心肌细胞膜损伤

　　缺血/再灌注对心肌细胞膜的损伤以LDH和CK从心肌细胞的漏出来衡量。CCPA组家兔冠脉流出液LDH和CK的含量明显低于对照组(P＜0.01)，提示ADOA1激动剂CCPA预处理能减轻家兔心脏的缺血/再灌注损伤。CCPA/Gli组家兔LDH和CK的漏出较CCPA组高(P＜0.01)，与对照组比较无显著差异(P＞0.05)(P＜0.01)，而单用Gli组与对照组比较也无显著差异(P＞0.05)，说明Gli本身不影响缺血/再灌注损伤过程，但可抑制CCPA对心肌细胞膜的保护作用。见表2。表2 各组心肌细胞膜损伤比较(略

)

　　2.5 心肌组织ATP

　　CCPA预处理组家兔心肌组织ATP含量明显高于对照组(P＜0.01)，提示ADOA1激动剂CCPA预处理可减少家兔心脏因缺血/再灌注引起的ATP消耗。CCPA/Gli组家兔ATP含量低于CCPA组(P＜0.01)，与对照组比较无显著差异(P＞0.05)，而单用Gli组与对照组比较也无显著差异(P＞0.05)，说明Gli本身不影响缺血/再灌注损伤过程，但可抑制CCPA对心肌细胞能量消耗的保护作用。见表2。

　　2.6 冠脉流出液NO含量

　　本文以冠脉流出液NO代表心肌组织中的NO水平。CCPA预处理组家兔心肌组织NO含量略高于对照组(31.4±5.3 vs 24.6±3.3，P＜0.01)；CCPA/Gli组家兔NO含量高于对照组(30.3±4.9，P＜0.01)，与CCPA组比较无统计学差异(P＞0.05)；单用Gli组与对照组比较无显著差异(25.3±3.7，P＞0.05)，这些结果说明Gli不影响家兔心肌缺血/再灌注时心肌组织NO的合成，而CCPA促进NO的合成。

　　2.7 心肌组织iNOS mRNA的表达

　　RTPCR法检测了各组家兔心肌组织iNOS mRNA的含量。内参照βactin的扩增产物在各组均相同，因此各组iNOS mRNA表达的差异与RNA提取过程和逆转录过程中RNA的用量无关。结果发现CCPA组心肌组织iNOS mRNA含量高于生理盐水对照组(1.68±0.22 vs 0.96±0.17，P＜0.01)；CCPA/Gli组iNOS mRNA的表达与CCPA组比较无统计学差异(1.71±0.20，P＞0.05)；单用Gli组与对照组比较无显著差异(0.91±0.12，P＞0.05)，这些结果说明CCPA可上调缺血/再灌注心肌组织iNOS的表达，而Gli对iNOS的表达无影响。

　　3 讨 论

　　3.1 ADO与延迟保护

　　ADO通过持久扩张冠脉，改善心肌供氧，促进葡萄糖内流，补充细胞内高能磷酸键池，增强心脏功能，并拮抗儿茶酚胺，使失衡的氧供需和能量代谢重新恢复平衡。此外，ADO还具有抑制内皮素的释放，防止血小板聚集，升高心肌细胞SOD的含量。缺血预处理使心肌在随后持续缺血/再灌注中，对内源性ADO的敏感性增高，ADO受体数目增多并呈高亲和状态，从而增强内源性ADO的作用〔4〕。Baxter等研究发现〔5〕：CCPA(0.1 mg/kg)预处理家兔心脏后24～72 h均可产生心肌保护作用，降低心肌梗死范围约50%。本实验观察到 CCPA预处理的家兔在随后第24小时的缺血/再灌注中尚能产生明显的心肌保护作用，包括缩小心肌梗死范围和促进缺血后心功能的恢复，产生明显的心肌保护作用。

　　3.2 KATP与延迟保护

　　KATP的开放具有对抗心肌缺血、缺氧的效应，且ADO的心肌保护作用大多由KATP介导完成。近来研究表明，KATP开放不但介导了ADO预处理的早期保护作用，还同时具有延迟性保护作用〔6，7〕。KATP阻滞剂5HD可消除ADO预处理带来的心肌保护作用。在本实验中，观察到KATP阻断剂Gli可拮抗CCPA预处理诱导的家兔心脏延迟保护作用，提示KATP参与了ADO预处理延迟保护作用的受体后信号转导，或者说KATP是ADO预处理延迟保护作用的效应子。目前多认为线粒体膜KATP的开放在心肌保护中起主要作用〔8〕。细胞膜KATP的特异阻断剂不能抑制预处理的保护作用，而较低浓度开放剂(仅能激活线粒体膜KATP)能诱导心肌的保护作用。

　　3.3 NO与延迟保护

　　缺血预处理后小鼠心脏的iNOS基因的表达轻度上调，且其延迟保护效应与NO合成有关。本实验中观察到iNOS在生理盐水组家兔心脏得到表达，且在 CCPA预处理后的家兔中的表达有所上调，而Gli组iNOS的表达水平与生理盐水组无明显差异，提示选择型ADOA1受体的活化可上调iNOS的表达。由于以往的研究多认为iNOS合成的NO可与氧反应生成氧自由基，对心肌组织产生毒性作用〔9〕。其可能原因有：①NO本身对心肌具有保护和毒性的双重作用；②CCPA诱导iNOS的表达仅轻度上调，而NO的毒性作用多在其过度增多有关；③CCPA诱导iNOS表达上调的同时可能促进SOD的合成，因而可以清除NO生成的氧自由基〔10〕。

　　3.4 KATP和NOS的关系

　　本研究采用CCPA模拟家兔缺血预处理的延迟性保护，发现NOS和KATP均在其中扮演了重要角色。研究表明，NO能升高细胞内第二信使cGMP水平，然后由cGMP依赖性蛋白激酶激活KATP，触发心肌保护〔11〕。CCPA诱导iNOS表达上调，从而激活KATP以介导延迟性保护，这一细胞内的信号转导通路尚不完全明确，可能与转录因子NFκB有关。

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