齐墩果酸对K562细胞bax、bclxL mRNA表达的影响

　　　　　　 作者：张鹏霞 薛芳喜 王迪迪

【摘要】 目的 探讨齐墩果酸（OA）对人慢性粒细胞白血病K562细胞bclxL和bax基因表达的影响。方法 采用光学显微镜观察OA对体外培养K562细胞的增殖抑制情况；并用RTPCR法检测bclxL和bax mRNA的表达。结果 与空白组和DMSO对照组比较，80 μmol/L OA处理细胞后，细胞增殖受抑制；OA用药组bax mRNA含量增加，bclxL mRNA含量减少。结论 OA可以诱导K562细胞凋亡，其机制可能通过上调bax基因表达及下调bclxL基因表达有关。

【关键词】 齐墩果酸；K562细胞；bcl2家族；基因表达

近年来国内外研究表明，齐墩果酸（Oleanolic Acid，OA）具有抑制HL60细胞凋亡作用〔1〕，但有关OA对慢性粒细胞白血病细胞作用及其确切机制尚不清楚。本实验通过观察OA对慢性粒细胞白血病K562细胞bclxL和bax基因表达的影响，初步探讨OA诱导K562细胞凋亡的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品与主要试剂

　　K562细胞株购自中国科学院上海细胞所；RPMI1640、胎牛血清均为 Hyclone公司产品；OA对照品购自中国药品生物制品检定所，分子式C30H48O3，分子量456.71；二甲基亚砜（DMSO）为中科院生物医学工程所产品；DEPC、DNA Marker及RTPCR试剂盒为大连宝生物产品，青霉素和链霉素购于北京索莱宝科技有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 药物配制

　　OA对照品溶于DMSO中，配制成80 mmol/L的储备液，-20℃储存，使用时用含10%胎牛血清的1640培养液配制成终浓度为800 μmol/L的工作液。

　　1.2.2 细胞培养及分组

　　K562细胞常规培养于含10%小牛血清，青霉素、链霉素各100 U/ml的RPMI1640培养基中，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱传代培养。根据培养时间的不同分为48 h和72 h处理组，每组又设空白对照组（RPMI1640培养基），DMSO溶媒对照组，根据本课题组前期实验结果〔3〕选择OA处理组浓度为80 μmol/L。每次实验重复3次。

　　1.2.3 细胞形态学观察

　　倒置显微镜下观察OA作用不同时间段时K562细胞的生长变化，观察细胞染色质和胞浆的变化。

　　1.2.4 RTPCR反应

　　采用Primer Premier5.0软件设计bax、bclxL及内参βactin基因PCR引物，引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成，引物序列及扩增片段大小如下： bax上游 5′GGATGCGTCCACCAAGAA3′，下游 5′CACTGTGACCTGCTCCAGAA3′，扩增序列长度为438 bp ； bclxL上游5′CTGAATCGGAGATGGAGACC3′，下游5′AGTGAGCCCAGCAGAACC3′，扩增序列长度为376 bp；内参βactin 基因上游 5′CGGGAAATCGTGCGTGACAT3′，下游 5′GAACTTTGGGGGATGCTGCTCGC3′，扩增序列长度为 712 bp。
　　取对数生长期细胞，培养48、72 h后，分别收集对照组和实验组细胞，采用Trizol试剂提取样本总RNA，紫外分光光度计测 OD260/ OD280，计算RNA浓度及纯度。RNA的反转录操作步骤按试剂盒说明进行。将反转录产物cDNA于94℃预变性4 min，94℃变性30 s，退火30 s，（bax和bclxL的退火温度分别为57.2℃、56.3℃），72℃延伸40 s，循环35次，最后72℃延伸10 min。PCR反应后取10 μl产物加样，在1.5%琼脂糖凝胶上80～120 V 电泳，EB溶液中染色，紫外透射凝胶图像分析仪上观察电泳结果并照相，计算目的基因与βactin灰度比值，进行目的基因表达的半定量分析。

　　1.3 统计学处理

　　实验数据以x±s表示，组间比较采用t检验，所有数据采用SPSS11.5医学统计学软件处理。

　　2 结 果

　　2.1 细胞形态学改变

　　随着处理时间的增加细胞增殖明显受抑制，有明显的时间依赖性，细胞形状不规则，部分出现膜皱缩、凋亡小体等凋亡标志。而对照组细胞大小均一，无明显的增殖抑制和形态学改变。见图1。

　　2.2 RTPCR结果

　　K562细胞的bax和bclxL表达分别见图2，半定量分析数值见表1。与空白对照组比较：DMSO组bax和bclxL mRNA表达量无明显变化（P＞0.05）；OA处理组与以上两处理组比较bax和bclxL mRNA各值表达量分别显著升高和降低（P＜0.05）。表1 不同时间、不同组bax、bclxL mRNA含量比较(略)

　　3 讨 论

　　目前研究表明，药物治疗肿瘤主要是引起肿瘤细胞凋亡。本研究发现，OA作用K562细胞48 h后，细胞数量减少，并出现凋亡小体等凋亡现象，表明OA可以诱导K562细胞凋亡。

　　细胞凋亡的调控机制十分复杂，一般认为细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡caspase；一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。bax基因在线粒体依赖性凋亡途径中，通过其在线粒体外膜聚合形成离子通道的方式促进cytc等蛋白分子释放以促进细胞凋亡〔2，3〕。当细胞接受凋亡信号的刺激时，bcl2家族中的bax自身结合形成多聚体而存在于线粒体外膜并形成跨膜通道，以至于cytc等蛋白分子经由该通道重新分布于细胞质与Apaf1、caspase9前体、ATP/dATP形成凋亡体，然后召集并激活caspase3，进而引发caspases级联反应，导致细胞凋亡。而抗凋亡类蛋白bcl2、bclxL等则可通过与bax竞争性地与ANT结合，或者直接阻止bax与ANT、VDAC的结合来发挥其抗凋亡效应〔4～6〕。

　　本实验RTPCR结果显示80 μmol/L OA作用K562细胞后，与空白组、DMSO组比较，bclxL mRNA表达下调，bax mRNA表达上调，并且具有时间依赖性。但与空白组比较DMSO组bax和bclxL基因表达变化不大，因此认为OA诱导K562细胞凋亡可能是通过线粒体途径，但对于OA具体作用在bclxL阻滞凋亡的哪一环节及作用机制尚需进一步研究。

参考文献

　1 Zhang P，Li H，Chen D，et al.Oleanolic acid induces apoptosis in human leukemia cells through caspase activation and poly (ADPribose) polymerase cleavage〔J〕.Acta Biochim Biophys Sin，2007;39(10)：8039.

　　2 Wong N，Diao CT，Wong T.The overexpression of Bcl2 antagonizes the proapoptotic function of the kappaopioid receptor〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2003;1010：35860.

　　3 胡 硕，胡成平.线粒体与细胞凋亡的研究进展〔J〕.国际呼吸杂志，2006；26（6）：4636.

　　4 孟祥东.BCL2家族与线粒体对细胞凋亡的调控〔J〕.细胞与分子免疫学杂志，2005；21：779.

　　5 Lin CF，Chen CL，Chang WT，et al.Bcl2 rescues ceramide and etoposideinduced mitochondrial apoptosis through blockage of caspase2 activation〔J〕.J Biol Chem，2005；280(25)：2375865.

　　6 Fan TJ，Han LH，Cong RS，et al.Caspase family proteases and apoptosis〔J〕.Acta Biochim Biophys Sin，2005；37(11)：71927.