作者：许霁虹 赵彦艳 张铁铮 刘晓江 于冬梅
【摘要】 目的 探讨重组人骨形态发生蛋白7(rhBMP7)对大鼠局灶脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法 采用线栓法建立局灶脑缺血再灌注模型，随机分为对照组（C组）、缺血再灌注组（I组）和rhBMP7处理组（B组），B组于再灌注开始前30 min给予rhBMP7 250 μg/ kg尾静脉注射，C组和I组给予等量生理盐水。于血流再灌注后24 h行神经功能缺陷评分后取脑，行脑含水量和梗死体积测定，计算脑梗死体积比，并电镜下观察脑超微结构变化。结果 B组大鼠脑局灶性缺血再灌注24 h后，神经功能缺陷评分明显下降，脑含水量和梗死体积比明显低于I组(P<0.01)。神经细胞的坏死程度也明显轻于I组。结论 rhBMP7缩小梗死体积，减轻脑水肿，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。
【关键词】 骨形态发生蛋白7；再灌注损伤;脑
近年发现，骨形态发生蛋白7（BMP7）可产生显著的抗缺血效应〔1，2〕，并对缺血大脑有内源性神经修复作用〔3〕，但国内外有关BMP7对缺血再灌注损伤影响的研究甚少。本研究观察重组人BMP7（rhBMP7）对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响，为脑缺血再灌注损伤的防治提供新的途径。
1 材料与方法
1.1 动物及分组 健康Wistar 大鼠48只，清洁级，雌雄不拘，6～8周龄，体重（243.1±35）g，由沈阳军区总医院动物实验科提供。随机分为3组：单纯缺血再灌注组（I组），行脑缺血2 h，再灌注24 h处理，再灌注开始前30 min尾静脉注射等量生理盐水；BMP7预处理组（B组），再灌注开始前30 min尾静脉注射rhBMP7 250 μg/kg，余同I组；假手术对照组（C组）：栓线仅插入8 mm，大脑中动脉起始部不阻塞。
1.2 试剂 rhBMP7蛋白（山东省生物技术研究中心产品，批号0523）。其他试剂均为国产生化纯试剂。
1.3 脑缺血再灌注模型制作 采用Longa大脑中动脉线栓法〔4〕，制备大鼠局灶性脑缺血再灌注(MCAO)模型。大鼠用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉。大鼠仰卧固定于手术台上，颈部正中切口，分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。结扎、游离颈外动脉主干。分离颈内动脉主干至翼腭动脉，结扎翼腭动脉。颈外动脉残端剪一小口，将栓线插入。轻推尼龙线尾端经颈总动脉叉部沿颈内动脉入颅。尼龙线插入深度由分叉部计(18.5±0.5)mm 。缺血再灌注组于术后2 h将尼龙线拔出。术中用白炽灯加温，维持大鼠肛温37℃左右。苏醒后自由饮水进食。于再灌注24 h取材检测。
1.4 神经功能缺损评分 MCAO模型制备后，观察动物神经功能缺损情况，采用Longa法进行神经功能缺损评分〔4〕。0分:无神经损伤体征；1分：不能完全伸直对侧前爪；2分：向外侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自主行走，意识丧失。
1.5 脑含水量测定 断头取脑枕顶叶脑皮质100 mg左右，于100℃恒温烘干24 h，根据公式计算：脑组织含水量（%）= (湿重－干重) / 湿重×100%。
1.6 脑梗死体积测定 每组随机取8只大鼠，在脑缺血再灌注后24 h，水合氯醛麻醉，快速断头取脑，置冰箱冷冻1 h后取出，行2 mm厚冠状切片。将切片立即置于2% 2，3，5三苯基氯化四氮唑溶液中(TTC，磷酸缓冲液调至pH为7.4)37℃恒温下避光染色30 min，正常组织染为红色，梗死组织染为白色。甲醛固定24 h。利用图像分析仪测每个脑片面积和梗死面积，根据公式V=t(A1+A2+…An)(A1+An)t/2计算梗死体积(V)，其中t为切片厚度，A为梗死面积。计算脑梗死体积比（%）=脑梗死体积/全脑体积×100%。
1.7 额叶皮质神经元超微结构观察 取大鼠脑梗死灶与正常交界处约1 mm ×1 mm ×2 mm组织，经2.5%戊二醛固定，1%锇酸固定后常规脱水，环氧树脂包埋，制成超薄切片。柠檬酸铅醋酸铀染色，JEM1200EX型透射电镜下观察脑组织超微结构变化。
1.8 统计学处理 采用SPSS13.0统计学软件进行分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 BMP7对脑缺血再灌注损伤神经功能缺损评分的影响 I组与C组比较有显著差异(P<0.01)，B组评分明显减少，与I组、C组比较均有显著性差异。见表1。
2.2 BMP7对脑缺血再灌注损伤脑含水量的影响 I组与C组比较有显著差异(P<0.01)，与I组比较，B组脑含水量明显降低。见表1。
2.3 BMP7对大鼠梗死灶体积的影响 脑梗死灶主要出现在B组与I组，C组未发现梗死病灶。I组及B组的梗死病灶主要位于额顶背外侧皮质、海马区、齿状回等区域。B组梗死病灶体积明显小于I组(P<0.05)。见表1。
表1 BMP7对脑缺血再灌注损伤各项指标的影响（略）
与C组比较：1）P<0.01；与I组比较：2）P<0.05
2.4 电镜超微结构观察 C组超微结构未见异常，核仁明显，线粒体嵴清晰。I组超微结构损伤严重，核呈高度固缩状态，核内染色质高度凝聚，细胞质高度水肿，细胞器减少，线粒体双膜结构不清，嵴断裂，溶解，甚至呈空泡。与I组比较，B组超微结构损伤均有不同程度的改善，表现为线粒体膜及嵴清晰，仅少数线粒体轻度肿胀。见图1。
图1 各组神经细胞电镜下超微结构改变(×5 000)（略）
3 讨论
脑缺血再灌注模型的选择对于其损伤机制的研究具有重要的意义，本研究采用大脑中动脉线拴方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，操作简便，损伤小，可以准确控制缺血和再灌注的时间，是目前制备局灶脑缺血模型的常用方法。同时本实验选择120 min为缺血时间，该缺血时间形成的脑损伤模型稳定，成功率高，与神经行为学评分、脑梗死灶体积及动物死亡率有较好的相关性〔5〕。对于脑梗死灶体积的测定及对神经细胞形态学的观察是判定脑缺血再灌注损伤最直观的方法。本实验中，大鼠局灶性脑缺血2 h，再灌注24 h后发生脑缺血再灌注损伤后，脑含水量增加，神经行为学发生相应变化，发生了脑梗死，说明脑的功能、形态和代谢发生了改变。缺血时细胞内ATP、CP产生严重减少，影响耗能离子泵的功能。造成细胞内钠水潴留。再灌注时，氧自由基产生加重了膜损伤，使细胞肿胀，影响了脑微循环，加重脑损伤，破坏了脑超微结构。
很多研究者围绕BMP对脑及其他器官的抗缺血性保护作用进行了大量的动物实验。BMP7也存在于脑脊液中，在脑组织受到暂时性缺血损害时，BMP7受体上调，能促进树突状神经细胞的生长及功能的恢复，对缺血大脑有内源性神经修复作用〔6〕。有实验将水合氯醛麻醉的成年鼠的右侧颈内动脉用丝线结扎引起一侧大脑中动脉阻塞60 min，再灌注24 h后，一组直接处死观察BMP7 mRNA的表达变化，结果发现BMP7 mRNA的表达量升高，另一组由尾静脉内注入BMP7，7 d后，应用BMP7治疗组鼠的肢体不对称症状较对照组有显著改善，14 d后活动功能上升，显示BMP7能通过缺血侧血脑屏障到达脑内且对远期神经系统功能的恢复发挥了积极作用〔6〕。本研究评价BMP7蛋白对局灶脑缺血再灌注损伤的影响，结果显示，与缺血再灌注组相比，BMP7预处理组大鼠神经缺损评分降低，脑含水量降低，脑组织TTC染色后的脑梗死灶体积显著减少；脑组织病理学观察显示，BMP7预处理组大鼠神经细胞损伤显著减轻，更进一步阐明rhBMP7预处理可以有效地抑制缺血/再灌注所致的脑组织损伤。
综上所述，应用rhBMP7预处理后，可减轻脑水肿，缩小梗死体积，改善神经行为学变化，对局灶性脑缺血再灌注损伤起到一定的保护作用。
参考文献
1 Vukicevic S，Basic V，Rogic D，et al.Osteogenic protein1 (bone morphogenetic protein7) reduces severity of injury after ischemic acute renal failure in rat〔J〕.J Clin Invest，1998；102(1):20214.
2 Lin SZ，Hoffer BJ，Kaplan P，et al.Osteogenic protein1 protects against cerebral infarction induced by MCA ligation in adult rats〔J〕.Stroke，1999；30(1)：12633.
3 Harvey BK，Hoffer BJ，Wang Y.Stroke and TGFbeta proteins：glial cell linederived neurotrophic factor and bone morphogenetic protein〔J〕. Pharmacol Ther，2005；105(2)：11325.
4 Long EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989；20(1)：8491.
5 王志萍，曾因明.线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的研究进展〔J〕.国外医学·麻醉学与复苏分册，2005;26(3)：14446.
6 Chang CF，Lin SZ，Chiang YH，et al.Intravenous administration of bone morphogenetic protein7 after ischemia improves motor function in stroke rats〔J〕.Stroke，2003；34(2):55864.