银杏、川芎制剂与骨髓基质细胞联合治疗局灶性脑缺血的实验研究

【摘要】 目的 探讨银杏、川芎制剂是否可以使骨髓基质细胞(MSCs)治疗局灶性脑缺血最佳时间窗延后。方法 SD大鼠随机分为对照组、MSCs组、MSCs+中药组，每组10只。采用线栓法制备大鼠缺血再灌注模型。MSCs 组尾静脉注入MSCs；MSCs +中药组静脉注入银杏、川芎制剂，48 h注入MSCs；对照组注入PBS。应用姿势反射实验和肢体不对称应用实验进行神经功能障碍评价，脑组织双免疫荧光组化检测。结果 MSCs 组、MSCs+中药组神经功能障碍程度明显好于对照组(P＜0.05)，两治疗组之间无显著差异(P＞0.05)。免疫组化显示，MSCs 组、MSCs+中药组在梗死灶部位BDNF及GFAP表达显著。结论 银杏、川芎制剂可使MSCs治疗时间窗延后，促进MSCs在脑病灶内分布、分化。

【关键词】 脑缺血；银杏；川芎；骨髓基质细胞

以往研究证实，骨髓基质细胞(MSCs)静脉移植治疗大鼠局灶性脑缺血疗效确实，可降低脑梗死体积，促进神经功能障碍的恢复〔1〕，静脉移植MSCs最佳时间窗是在缺血发生后3～24 h，临床在最佳时间窗内应用MSCs治疗局灶性脑缺血可达到理想效果。川芎活性成分川芎嗪和阿魏酸具有扩张血管，抑制血小板活性作用〔2〕，银杏活性成分为黄酮类和萜内脂类，具有扩张血管、增加脑血流、抗氧化、抗自由基等脑保护作用〔3〕。本研究采用复方中药银杏、川芎制剂联合MSCs治疗大鼠局灶性脑缺血，探讨银杏、川芎制剂是否可以使MSCs治疗最佳时间窗延后，是否能促进MSCs在脑病灶内分布、分化。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 3月龄SpragueDawley(SD)雄性大鼠30只，体重230～280 g，由吉林大学新民校区实验动物中心提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 试剂 MSCs：Ori Cell TM间充质干细胞冻存标本(广州赛业生物科技有限公司)，复苏后调整细胞浓度3×106。复方中药制备：银杏叶提取物、川芎嗪按20∶5(5 mg/ml)制成无菌液(长春长云生物制药股份有限公司)。BrdU(5溴脱氧尿核苷5Bromo2deoxyuridine)美国Sigma公司。BrdU〔Bromodeoxyuridine 溴代脱氧尿(嘧啶核)苷〕、GFAP(胶质纤维酸性蛋白)及一抗，SABCFITC均购自武汉博士德生物工程公司(博士德公司分装)。

　　1.2.2 模型制备 参照Zea Longa法制备局灶性脑缺血再灌注大鼠模型。切开一侧颈部皮肤，手术显微镜下分离右颈总动脉、颈外动脉及其分支动脉，接近颅底部位电灼后结扎切断颈外动脉，分离颈内动脉至鼓泡处，并暴露出翼腭动脉。在颈内动脉远端备线并放置动脉夹，在近心端距颈总动脉分叉0.5 cm处用7号注射器针穿刺颈总动脉，注入少许肝素钠盐水，插入40尼龙线23～25 mm，进入规定深度遇轻微阻力后停止，扎紧备线，栓线在皮肤外留有1 cm长线头，缝合皮肤。MCA阻断后2 h将栓线撤至颈总动脉，麻醉苏醒后大鼠左侧前肢体瘫、走路向一侧偏斜、右眼睑低垂为局灶性脑缺血再灌注制备成功模型。随机分为对照组、MSCs组、MSCs+中药组，每组10只。

　　1.2.3 给药方法 各组大鼠在规定时限前3 d开始腹腔内注射BrdU(50 mg/kg)，每日2次，共6次。制备局灶性脑缺血再灌注模型后2 h，对照组静脉注射PBS 2 ml，MSCs 组尾静脉注入MSCs 2 ml。MSCs +中药组于制备局灶性脑缺血再灌注模型后5 h静脉注入银杏、川芎制剂2 ml(5 mg/ml)，每日2次，48 h尾静脉注入MSCs 2 ml。

　　1.2.4 行为学检测 治疗后5、7、14 d用姿势反射实验和肢体不对称应用实验〔4，5〕评价大鼠神经功能障碍严重程度。肢体不对称应用实验：用于测试的器械为一直径18 cm、高30 cm透明的玻璃圆桶，正常大鼠在圆桶中会不时站立，用双侧前肢交替或同时触及桶壁，应用双侧前肢的频率应该相等。有缺血性脑损伤的大鼠偏瘫侧肢体应用较少，观察并记录双侧前肢的应用情况，对每只大鼠每次记录20次活动。以肢体应用的百分率计算最后得分，得分=(R-L)/(R+L+B)×100%，R:右侧前肢(健侧)独立应用次数;L:左侧前肢(患侧)独立应用次数;B:双前肢同时应用次数。姿势反射实验:距地面1 m提起鼠尾，观察其前肢屈曲情况，每次每只大鼠记录20次活动，评分标准：0分(正常)，双前肢完全伸展；1分(轻度异常)，左前肢贴向前胸，右前肢伸展；2分(重度异常):左前肢贴向前胸，上半身卷曲。每只大鼠每次的最后得分为20次评分的平均分。

　　1.2.5 免疫组织化学检测 各组大鼠开胸，行内固定，以视交叉和其后4 mm处两点行冠状切片，再次甲醛固定，经酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。使用双标免疫组化染色法确定由骨髓基质来源的细胞，按照SABCFITC检测试剂盒指导使用。切片用Zeiss LSM510激光扫描共聚焦显微镜检测切片，细胞核绿色，细胞质呈玫瑰红。

　　1.3 统计学分析 所有数据以x±s表示，应用SPSS10.0统计软件包进行单因素方差分析(ANOVA)，如有统计学意义进一步作StudentNewman Keuls检验，进行两两比较。

　　2 结果

　　2.1 神经缺损评分 MSCs组与MSCs＋中药组比较，两组大鼠神经缺损评分无明显差异。与对照组比较，第7天和第14天细胞移植组较对照组神经功能有明显改善(P＜0.05)。

　　2.2 组织学改变 见图1。组织病理切片中均有BDNF与GFAP表达，MSCs组和MSCs+中药组BDNF、GFAP染色阳性细胞明显增加，对照组阳性率明显下降。双标免疫组化法表明，一些BrdU阳性细胞表现神经胶质标记物GFAP阳性反应。

　　图1 免疫组化检测BDNF阳性细胞（略）

　　3 讨论
　　
　　中药可诱导骨髓MSCs的定向分化，但在局灶性脑缺血性损伤时对MSCs的作用需要进一步研究。研究发现，有些中药成分通过影响MSCs分泌一些细胞因子促进造血干细胞的分化增殖，或者促进MSCs和造血干细胞的黏附而起作用，从而调节造血干细胞的增殖分化〔6〕。现代医学研究证实，中药有效治疗脑缺血性疾病很大程度上与通过对MSCs的影响，促进骨髓细胞的增殖分化，调节造血干细胞的增殖作用有关。川芎嗪是从中药川芎根茎中提取的有效成分，具有活血化瘀、扩张血管、抑制血小板聚集和改善微循环等作用〔7〕。有研究显示，川芎嗪可能通过促进成年大鼠海马SGZ增殖，显著减少大鼠脑缺血边缘区神经元的凋亡而改善局灶性脑缺血所引起的神经功能缺失〔8，9〕。川芎嗪能提高缺血侧顶叶皮质的神经元数量，增强FAK(聚焦黏附蛋白)的表达，从而促进MSCs的增殖并且增强MSCs的黏附作用〔10，11〕。银杏叶制剂对急性缺血性脑血管疾病有明显的治疗作用，研究发现，银杏叶提取物EGb761治疗脑梗死，可使脑梗死体积下降约40%〔12，13〕，治疗机制主要包括对鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用，降低细胞凋亡，降低脑谷胱甘肽过氧化物酶抑制作用和三磷酸腺苷酶活性，减轻脑海马区亚细胞损伤〔14～17〕。本研究表明，联合银杏叶与川芎嗪制剂治疗脑缺血损伤，综合两种药物的作用可达到治疗目的。
　　
　　MSCs在脑缺血损伤修复中起重要作用，可促进神经系统缺损修复，降低中风后的功能缺失〔18〕。有人将 MSCs通过静脉途径注射后治疗脑缺血性损伤，MSCs可选择性的进入缺血脑组织中，对缺血性脑损伤导致的神经功能障碍有明显的治疗作用〔19〕。MSCs刺激内源性星形细胞信号，或改变缺血环境，促进脑重新塑形，促进中风后神经功能改善〔20〕。Zhang〔19〕用人MSCs治疗大鼠局灶性脑缺血，发现在缺血病灶部位血管生成显著提高，并认为hMSCs是新生血管的重要活化剂，hMSCs通过损伤脑组织发挥作用，介导内源性VEGF和VEGFR2表达增加，新生血管提高缺血灶周围组织灌注。动脉内移植大鼠MSCs，在缺血早期阶段恢复脑血流和血脑屏障，治疗效果与移植的MSCs呈数目依赖关系〔21〕。本研究表明，对照组病灶内表达BDNF阳性细胞表达较少，而MSCs治疗组和中药＋MSCs治疗组病灶内BDNF阳性细胞表达明显丰富。
　　
　　综上，局灶脑缺血损伤后2 h应用MSCs，其结果与缺血后用中药治疗2 d再应用MSCs无明显差别，说明复方中药对脑组织有保护作用，对MSCs治疗脑缺血性损伤有明显的促进作用，延长了MSCs的治疗应用时间，并能促进神经功能障碍恢复。

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