白介素8对兔腹主动脉粥样硬化狭窄的影响

　　　　　　 作者：齐晓勇 孟存良 李英肖 党懿 刘惠良

　　　　　　王天红 袁华兵 倪艳辉 刘 光 武振朝 郜利会

【摘要】 目的 观察白介素8（IL8）水平对兔腹主动脉粥样硬化狭窄的影响。方法 新西兰大白兔36只随机分为实验组、IL8单克隆抗体治疗组、对照组。实验组和治疗组动物通过穿刺股动脉送入球囊拉伤腹主动脉。治疗组动物通过耳缘静脉注射IL8单克隆抗体进行干预。对照组动物只进行股动脉穿刺和留置鞘管，不进行球囊扩张拉伤。分别于实验前，实验后4 h、1 d、3 d，1 w、2 w、4 w，耳缘静脉采血4 ml，检测三组动物血清IL8水平，4 w后处死动物进行病理组织学检查，应用光学显微镜和计算机病理图像分析系统分析测定以下指标：内膜中膜厚度、面积，计算血管狭窄程度。结果 实验组动物球囊损伤4 h后IL8水平即开始升高，术后1 d达到峰值，持续增高4 w，且明显高于治疗组和对照组。治疗组和对照组动物IL8水平无上述变化规律。实验组动物腹主动脉明显狭窄，组织学检查内膜面积和中膜面积、血管狭窄程度等指标大于治疗组和对照组（P<0.01），治疗组管腔狭窄，对照组动物管腔无明显变化，治疗组与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。相关分析显示，IL8水平与内膜厚度、内膜面积、中膜厚度、中膜面积等呈正相关(相关系数r分别为0.894，0.783，0.801，0.912，均P<0.01)。结论 IL8水平高表达引起腹主动脉粥样硬化狭窄的产生，经IL8单克隆抗体治疗后动脉狭窄程度明显减轻。IL8水平与动脉狭窄程度呈正相关，是发生腹主动脉粥样硬化狭窄的独立危险因素。

【关键词】 腹主动脉；动脉粥样硬化；炎性反应；白介素8；单克隆抗体

　　【Abstract】 Objective To observe the effects of interleukin8 (IL8) on atherosclerosis(AS) of abdominal aorta in rabbits. Methods Thirtysix New Zealand white rabbits were randomly pided into experiment， treatment and control groups， each group 12 cases. Rabbits in experiment and treatment groups were injuried in abdominal aorta by balloon inflation after punctured in femoral artery. Monoclonal antibody of IL8 was injected by venous in rabbits of treatment group. Rabbits in control group were punctured only in femoral artery. Peripheral blood was collected before experiment and 4 h， 1， 3 d， 1， 2， 4 w later. The level of IL8 was measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) respectively. The luminals of abdomial aorta in three groups were observed 4 w later. Histopathologic examination was performed. Such contents as follows were assayed by light microscope and computer image analysis system: luminal area， intima and tunica media area， angiostenosis of blood vessel. Results The level of IL8 was raised in 4 h and achieved to peak in 1 d after balloon inflation in rabbits of experiment group. The higher level of this inflammatory factor lasted 4 w. There was no variation above in treatment and control groups. It was observed that abdominal aorta became stenosis obviously in experiment group. The area of intima and tunica media as well as the extent of stenosis in experiment group were bigger than those in treatment and control groups. There was no statistical difference between treatment and control groups. Correlation analysis indicated that there were positive relations between IL8 and thickness， area of intima and tunica medias respectively(r=0.894，0.783，0.801，0.912，P<0.01). Multiple regression analysis of Logistic indicated that IL8 was an independent risk for the AS（P<0.01）. The high levels of IL8 leaded to AS in abdominal aorta of rabbits. The severity of stenosis became lessen after intervention by monoclonal antibody of IL8. Positive corelation was found between the level of IL8 and severity of arterial stenosis. IL8 was one of independent risks factor leading occurrence and development of AS. Conclusions The high levels of IL8 leads to AS in abdominal aorta of rabbits. The severity of stenosis becomes lessen after intervention by monoclonal antibody of IL8. Positive corelation is found between the level of IL8 and severity of arterial stenosis. IL8 is one of independent risks factor leading occurrence and development of AS.

　　【Key words】 Abdominal aorta; Atherosclerosis; Inflammatory reaction; Interleukin8; Monoclonal antibody

　　目前研究已经证实，炎性反应在动脉粥样硬化（AS）的发生与发展中起到重要的作用。参与AS形成的炎性因子众多，且互相影响，因此观察炎性因子的变化规律，了解炎性因子与AS病变的关系与作用机制，有助于寻找临床干预AS的新方法。白细胞介素8（Interleukin8，IL8）是体内重要的炎性因子，可促使血液中单核细胞聚集到内膜上及向内膜下转移。本研究拟采用IL8单克隆抗体进行干预治疗，观察干预治疗后IL8水平变化以及对腹主动脉AS狭窄的影响，为临床治疗AS性疾病提供新思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与分组

　　选取8～12月龄新西兰大白兔36只，雌雄不拘，体质量2.50～3.25 kg，由河北医科大学实验动物中心提供(许可证号：SCXK(冀)20031003)。以上实验动物随机分为球囊拉伤组（实验组，n=12）和IL8单克隆抗体干预组（治疗组，n=12）以及对照组（n=12）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 兔腹主动脉AS模型的建立

　　实验动物术前12 h禁食，不禁水，称体重。常规建立耳缘静脉输液通路，以10 g/L戊巴比妥钠3.0～3.5 ml/kg耳缘静脉注射麻醉实验动物，麻醉后动物仰卧固定于手术台，以20%硫化钠双侧腹股沟脱毛。常规消毒铺巾后，seldinger技术穿刺股动脉并留置鞘管，经鞘管注入普通肝素200单位抗凝，沿导引钢丝逆行插入球囊，连接手推式压力表，造影后将球囊定位，置于髂动脉以上2个椎体处，以405.30～607.95 kPa压力扩张球囊，同时注射造影剂证实球囊完全扩张堵闭腹主动脉，自近心端缓慢回拉(拉伤长度4 cm)，反复3次，每次球囊扩张持续时间20 s，每次间隔15 s，撤出球囊，拔除动脉鞘管，压迫止血15 min后，绷带包扎固定，4 h后解除绷带包扎。

　　1.2.2 IL8单克隆抗体的干预治疗

　　干预组动物实验前开始通过耳缘静脉注射IL8单克隆抗体2 mg/kg，连续3 d。

　　1.2.3 病理学检查

　　剥离腹主动脉大体标本（胸主动脉至髂动脉分叉处）。剪除血管外结缔组织及脂肪，生理盐水冲洗残血。截取成形部位及对照组血管标本，立即放入10%福尔马林溶液内浸泡固定。常规酒精脱水，石蜡包埋，制成3 μm厚连续切片24 h，给予苏木素伊红（HE）染色。利用HE染色的切片，随机选取5个视野，在≤40倍光镜下，利用微机图像处理测量系统对切片进行图像摄取和转换，测量斑块纤维帽及新生内膜厚度（IT）、中膜厚度(MT)、内膜面积(IA)、中膜面积(MA)，计算血管狭窄程度、IT/MT比值，以及IA/MA比值。

　　1.3 统计学方法

　　采用SPSS13.0软件包完成统计处理，先进行组间均衡性检验，计量资料以x±s表示，采用χ2检验。先行方差分析，然后再作多组均数的q检验，相关资料采用相关分析法计算相关系数，并进行多元Logistic回归分析。

　　2 结 果

　　2.1 三组实验动物之间体重、月龄、性别、血脂等一般情况比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。表1 三组动物一般情况比较(略)

　　2.2 三组动物术前、术后IL8水平比较

　　术前三组IL8水平无明显差异；术后4 h实验组IL8水平较术前以及干预组和对照组明显升高，术后1 d达到峰值，持续增高4 w。干预组与治疗组无上述变化趋势，干预组显著低于实验组（P<0.01），与对照组比较，无显著性差异(P>0.05)，见表2。表2 三组之间不同时间点IL8水平(略)

　　2.3 三组动物病理形态学改变

　　HE染色可见对照组动脉内膜光滑，内皮下有少量结缔组织，无平滑肌细胞存在，中膜平滑肌细胞成梭形，环绕管腔排列；实验组兔内膜、中膜明显增厚，管腔明显狭窄，内膜下平滑肌细胞明显增生，而且排列不规则，内皮及内皮下层水肿变性，弹性纤维层结构不清，斑块隆起明显，内含大量泡沫细胞；治疗组内膜、中膜亦有不同程度的增厚，管腔有所狭窄，较多中膜平滑肌细胞增生迁移至内膜下，但增生以及狭窄程度均明显轻于模型组。见图1。表3 三组之间动脉狭窄程度、内膜中膜厚度面积比较(略)

　　2.4 三组之间动脉狭窄程度、IT、MT、IA、MA比较

　　实验组与治疗组和对照组比较，动脉狭窄程度、IT、、MT、TA、MA显著增高（P<0.01），治疗组虽高于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
表4 腹主动脉狭窄的多元回归分析(略)

　　2.6 腹主动脉狭窄的多元回归分析

　　以术后腹主动脉是否发生＞50%狭窄为因变量，月龄、术前体重、术后体重，术前、后甘油三酯（TG），术、前后总胆固醇（TC），术前、后高密度脂蛋白胆固醇（HDLC），术前、后低密度脂蛋白胆固醇（LDLC），术前、后各个时间点IL8水平等均作为自变量，进行多元Logistic逐步回归分析，发现进入模型的变量为术后1 d IL8水平，其对于腹主动脉狭窄发生的危险性比值（RR）为1.674（95%可信区间1.164～2.530，P=0.001）。表明术后IL8峰值为腹主动脉狭窄发生的独立危险因素，见表4。

　　3 讨 论

　　炎性反应在AS中的作用越来越受到人们重视，AS形成的炎症学说〔1〕认为，炎症是AS发病的重要原因，参与AS斑块的形成、破裂及血栓形成，各阶段均出现血管损伤的炎性反应〔2〕。炎症反应可同时存在于斑块局部及全身炎症系统。研究已经证明IL8等趋化因子及其特异性受体在AS中起重要作用〔3〕。
　　
　　IL8主要来源于单核巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞等，可刺激C反应蛋白（CRP）、血清淀粉样蛋白A(SAA)、血管细胞黏附分子1（VCAM1）表达，并抑制金属蛋白酶抑制因子（TIMP）的活性，加强氧化应激和细胞凋亡等，导致患者临床表现不稳定。组织中高浓度的IL8可以增强中性粒细胞黏附、移行，而循环中的IL8阻止中性粒细胞的游走并黏附于内皮细胞〔4，5〕，研究表明在凝血因子激活和细胞活素级联之间，IL8是二者相互作用的一个关键因素。

　　Rornuk等〔6〕研究冠心病患者的血浆IL8水平变化，发现不稳定型心绞痛患者的血IL8水平明显高于稳定型心绞痛患者和对照组，提示IL8在一定程度上反映冠状AS斑块的稳定性。IL8的释放可能是心绞痛患者冠状动脉病变局部炎性激活和凝血异常反应的标志，也是冠状动脉病变不稳定的信号。研究证实〔7〕，心绞痛（UA）患者血浆IL8表达在A型、B型、C型病变组依次增加，并与冠状动脉狭窄直径呈正相关。

　　有研究证实，AS形成过程中IL8可以吸引T淋巴细胞，同时它也是血管生长因子，能诱导平滑肌细胞(SMC)增殖、移行〔8〕，对中性粒细胞有激活作用，可诱导其变形、趋化、脱颗粒、胞质内钙短暂上升等。此外，IL8也可以对T淋巴细胞和嗜碱性粒细胞有趋化作用，因此，IL8在炎症局部发挥了重要的作用〔9〕。

　　Koch等〔10〕研究认为，IL8可能通过其血管生长因子特性参与AS的病理过程。Rus等〔11〕研究发现AS管壁中IL6和IL8的蛋白和基因表达都比正常管壁中高。聂永梅等〔12〕通过建立AS模型，动态监测了整个AS过程中IL8的蛋白和基因表达，发现IL8的蛋白和基因上调主要是在高脂血症家兔AS模型的脂纹期。由此可见，AS与IL8的升高密切相关。IL8和黏附分子家族中的重要成员VCAM1参与了AS的形成过程〔13，14〕。

　　IL8能刺激中性粒细胞、T细胞趋化、游走，而且和MCP1一起促进牢固的单核细胞附壁〔15〕。有研究表明，IL8可以诱导单核细胞黏附到血管内皮，而单核细胞和内皮细胞之间的黏附可以诱导二者的激活，使其在无需其他刺激的情况下就能产生IL8，加剧了局部的炎症病变〔16，17〕。在转基因高TC血症的老鼠敲除了IL8的趋化因子受体（CXCR）2，可以缩小AS斑块〔18〕。
　　本文前期研究中发现，兔腹主动脉球囊扩张术后引起炎性反应的发生与增强，在参与其中的炎性因子中，包括IL8、IL6、TNF、CRP等，IL8最先升高，达峰值时间最短，相关分析显示IL8水平与IL6等表达呈正相关。推测在上述炎性反应中，IL8可能起到了关键的调节作用。

　　在本研究中，球囊损伤兔腹主动脉后引起IL8水平的高表达，实验组显著高于对照组，同时腹主动脉狭窄程度、IT及MT、IA及MA等明显增加。在兔球囊扩张术后进一步采用IL8单克隆抗体经耳缘静脉注射干预治疗后，IL8水平与实验组比较显著下降，峰值消失。病理检查结果显示，腹主动脉狭窄程度以及IT、MT、IA及MA和上述二者的比值等指标均明显下降，与对照组比较无显著性差异。直线相关分析显示，IL8水平与上述动脉狭窄指标均呈正相关，多元Losgitic回归分析表明，IL8水平是引起腹主动脉狭窄的独立危险因素，说明IL8在引起AS发展的病理进程中，起到了关键作用。

　　综上所述，本研究证实了IL8和AS病变之间的关系，提示IL8单克隆抗体治疗可有效降低IL8水平，抑制炎性反应激活程度，阻遏AS的发展，有必要进行下一步的深入研究，为临床干预治疗AS性疾病寻找新的治疗方向。

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