GABA受体基因转染对癫痫大鼠海马CX32表达的影响

　　　　 作者：孟红梅 王赞 崔俐 张淑琴 林卫红

【摘要】 目的 探讨在下丘脑乳头体上核内转染γ氨基丁酸(GABA)受体基因后对海人酸(KA)致痫大鼠海马区缝隙连接蛋白32(CX32)表达的影响。方法 在右侧杏仁核内注射KA制备癫痫动物模型作对照组，GABA基因转染组则利用仙台病毒(HVJ)脂质体转染法预先在下丘脑的乳头体上核内转染被脂质体包被的GABA受体基因，48 h后在杏仁核内注射KA，两组大鼠分别进行CX32原位杂交观察。结果 GABA基因转染组大鼠CX32表达在各个时程均有下降。结论 下丘脑内转染GABA受体基因后可以抑制癫痫发作的程度。

【关键词】 癫痫；海人酸；缝隙连接蛋白

对于难治性癫痫目前主要是手术治疗，但常常因为创伤较大而不易为患者接受。随着基因技术的发展，人们开始试图利用基因转染技术进行局部药物注射，以阻断癫痫的传播通路。在癫痫的形成过程中海马起重要作用，癫痫波传播的主要通路是沿着内嗅皮层传导到海马，另外还有一些旁路因素对癫痫的传播产生影响，如下丘脑的乳头体上核也发出一些联系纤维与海马相关联。本研究采用大鼠杏仁核内注射海人酸（KA）作为癫痫动物模型〔1〕，通过仙台病毒（HVJ）脂质体基因转染技术，将γ氨基丁酸（GABA）受体基因转染到下丘脑的乳头体上核，观察其对于大鼠海马区缝隙连接蛋白32(CX32)表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　Wistar雄性大鼠22只（体重250～300 g）、GABAmyc融合基因、脂质体、HVJ、玻璃管、微量注射器、立体手术定位仪、手术器械。

　　1.2 实验动物分组

　　分为3组：正常对照组、KA对照组及GABA基因转染组（详见动物模型制备）。

　　1.3 HVJ脂质体基因转染技术〔2〕

　　将被脂质体包被的GABA受体与事先用紫外线照射破坏自身基因的HVJ在37℃条件下反应，制成HVJ脂质体，进而再与细胞膜直接融合将DNA高效导入细胞内。

　　1.4 动物模型制备

　　KA对照组将大鼠麻醉固定，立体定位仪下在右侧杏仁核内注射KA 0.1 μg（前囟后5.5 mm，中线右侧5.0 mm，深度7.2 mm）。GABA基因转染组则在KA注射前48 h预先将GABA mRNA注射到下丘脑的乳头体上核(前囟后3.5 mm，中线旁开各0.2 mm，深度7.5 mm)。

　　1.5 CX32原位杂交染色

　　各组大鼠分别在注射KA后3、6、24、48 h、3、7 d取海马区进行原位杂交染色并观察。

　　1.6 统计学分析

　　各组间比较采用方差分析，成组数据的比较采用t检验。

　　2 结 果

　　CX32主要分布于神经细胞内。正常海马各区及皮层CX32阳性细胞稀少，胞浆与胞膜着色。KA注射3 h后大鼠的海马各区CX32的表达迅速增多，并持续上升，第3天达高峰，后逐渐下降，其中CA3区表现明显，CA2和齿状回(DG)区变化不明显；GABA基因转染组大鼠CX32表达与KA对照组相比其阳性细胞数明显减少，有显著性差异(P＜0.05)。见图，表1。表1 各组大鼠海马CX32免疫反应阳性细胞数的比较（略）

　　3 讨 论

　　基因治疗的关键是基因转移，由于脂质体转染靶向性不强，易被吞噬细胞清除，为提高转染效率，将HVJ与脂质体融合，即把目的基因封入脂质体内，利用HVJ的细胞融合作用把目的基因导入细胞质内，从而实现活体组织内的基因转染。文献报道〔3〕，在下丘脑乳头体上核内转入兴奋性受体基因后可使大鼠的癫痫发作程度明显加重，推测下丘脑与海马区之间的联系通路可能在癫痫的发病中起重要作用。本研究进一步在下丘脑内转染抑制性受体基因，观察其对癫痫的治疗作用。

　　CX32主要分布在神经元上，参与神经元的电活动、神经元的发育〔4，5〕及参与传递第二信使和一些必需代谢产物〔6〕。神经元之间由缝隙连接（GJ）蛋白形成的电突触可能在神经元的同步放电中起作用，而神经元的同步放电是产生惊厥的基础。癫痫发作时机体为了适应这种反复的过度电活动的环境，其早期表现为加强CX的合成和利用，以便于维持高频脑电环境下神经元自身的基本功能，因而早期CX32的表达有所增强，但随着癫痫的这种高频脑电活动的持续发生，大量兴奋性氨基酸的释放、钙超载、氧和葡萄糖相对供应不足，脑内ATP储存减少，造成钠泵功能抑制，进一步加重脑损害，致使神经细胞数量明显减少，因而CX32表达随之减少。上述结果表明，由CX32组成的神经元上的GJ蛋白在癫痫的始动和发生上有一定的作用。而在下丘脑内转染GABA受体基因后使CX32 mRNA的表达在各个时程均有所减少，说明其抑制了癫痫发作的程度。上述结果说明基因转染法是治疗难治性癫痫的一种较为理想的方法。

参考文献

　　1 Sperk G.Kainic acid seizures in the rat〔J〕.Prog Neurobiol，1994；42（1）:132.

　　2 Kaneda Y，Saeki Y，Morishita R.Gene therapy using HVJliposomes：the best of both worlds〔J〕?Mol Med Today，1999；5(7)：298303.

　　3 孟红梅，张淑琴，佐治真理，等.GluR2Q在下丘脑乳头体上核内过度表达对于大鼠颞叶癫痫脑电的影响〔J〕.中风与神经疾病杂志，2002；19(2)：768.

　　4 Wallraff A，Kohling R，Heinemann U，et al.The impact of astrocytic gap junctional coupling on potassium buffering in the hippocampus〔J〕.J Neurosci，2006；26(20):543847.

　　5 Haas B，Schipke CG，Peters O，et al.Activitydependent ATPwaves in the mouse neocortex are independent from astrocytic calcium waves〔J〕. Cereb Cortex，2006；16(2):23746.

　　6 Dermietzel R.Gap junction wiring:a new Principle in celltocell communication in the nervous system〔J〕.Brain Res Rev，1998；26:176 83.