CCK8对糖尿病大鼠胰岛细胞损伤保护相关蛋白质的实验分析

　　　　作者：刘晓燕 李洪 李娟 王丽 段承刚 陶忠桦 何涛

【摘要】 目的 探讨八肽胆囊收缩素（CCK8）对糖尿病大鼠胰岛细胞损伤的保护作用。方法 检测CCK8对链脲佐菌素（STZ）致糖尿病大鼠模型的刺激前后血糖和血清胰岛素的水平，采用双向电泳并结合生物信息学方法，观察刺激前后胰腺组织蛋白质表达的差异。结果 初步确定了CCK8刺激引起胰岛细胞JIP1、RBBP7、PP2AB、PDX1、BCLX 5种蛋白质的表达明显增强，这些蛋白在促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、刺激胰岛素基因表达等方面发挥重要作用。结论 CCK8可能通过刺激特异蛋白质的表达，对糖尿病大鼠受损胰岛细胞起到一定的保护和恢复作用。

【关键词】 CCK8；糖尿病模型；胰岛细胞；蛋白质表达；大鼠

胆囊收缩素（CCK）是广泛分布于胃肠道及中枢和周围神经系统一种典型的脑肠肽，具有生物学功能的多样性，CCK8是具有CCK完全功能的最小活性片段，在种属间具有相对保守性。研究发现CCK有明显的刺激胰岛素分泌的作用，也是调节胰腺细胞再生的主要胃肠激素〔1，2〕。近来的有关CCK8治疗2型糖尿病的研究显示，CCK及其类似物是极具潜力的2型糖尿病的治疗药物〔3～5〕。但目前有关CCK对于糖尿病胰岛细胞损伤是否具有保护作用及其机制还知之甚少。本研究在建立糖尿病大鼠模型的基础上，采用双向电泳等技术观察CCK8是否通过刺激特异性蛋白质的表达，进一步深化对CCK8胰腺保护作用的认识，拓展CCK及其类似物在2型糖尿病治疗中的应用提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及主要试剂

　　SD大鼠（重庆腾鑫生物技术有限公司）；CCK8和链脲佐菌素 (STZ)购自Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、超纯尿素、二硫苏糖醇、CHAPS、甘氨酸、甲基乙二胺(TEMED)、磷酸三丁酯(TBP)、过硫酸铵（APS）、十二烷基磺酸钠（SDS）、固相pH梯度干胶条（pH 3～10，17 cm）和矿物油均购自BioRad公司；枸橼酸钠购自中国上海试剂一厂；蛋白分子量Marker和苯甲基磺酰氟（PMSF）购自碧云天生物技术研究所；125I胰岛素放射免疫试剂盒购自北京普尔伟业生物科技有限公司。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 分组及糖尿病模型的建造

　　SD大鼠68只，随机分为正常对照组和糖尿病模型组。糖尿病模型组大鼠禁食10 h，按55 mg/kg腹腔内注射STZ溶液（用0.1%无菌枸橼酸钠缓冲液新鲜配制成2%溶液，调pH=4.5，过滤除菌）。

　　1.2.2 CCK8的注射

　　随机取对照组和糖尿病模型组大鼠各30只，腹腔内分别注射生理盐水0.1 ml或10-6mol/L CCK8 0.1 ml，于1、2及3 d后各时间点处死大鼠10只，取血清及胰腺组织-80℃冻存待用。

　　1.2.3 血清胰岛素及血糖的测定

　　各组血清胰岛素浓度采用125I放射免疫法进行检测。各组SD大鼠于造模前后和给药前后采用血糖仪（德国罗氏诊断公司）检测尾静脉血血糖浓度。

　　1.2.4 蛋白样品的制备

　　取50 mg胰腺组织加入300 μl裂解液（8 mol/L尿素+0.2%Biolyte+0.1%CHAPS+15 μl PMSF），剪刀剪碎并用小圆头玻棒研磨，冰上裂解30 min，12 000 r/mim离心60 min。取上清液用Bradford法测蛋白浓度，分装，-80℃冻存。

　　1.2.5 蛋白质组双向电泳分离

　　分别取各组蛋白样品800 mg，加水化液（裂解液+DTT 0.01 g/L+Biolyte 5 μl/ml+0.1%溴酚蓝10 μl）至总量300 μl/胶条，混匀后加入水化槽，将胶条放置1 h后加入矿物油覆盖过夜。将水化后的胶条转移至等电聚焦电泳系统(BioRad)，于17℃进行聚焦，程序设置为250 V，30 min →1 000 V，1 h → 10 000 V，5 h → 10 000 V，6 h → 250 V，2 h，总伏时数约为8万伏时。取出胶条，加入平衡液（6 mol/L尿素+2％SDS+20％甘油+0.375 mol/L TrisHCl，pH=8.8）+20%DTT，平衡15 min；再将胶条小心放于10%分离胶顶端，用0.5%的琼脂糖（含少量溴酚蓝）封闭胶条进行第二向SDSPAGE电泳，电泳参数为10 mA/胶条，1 h；以后为20 mA/胶条。待溴酚蓝接近分离胶底端时停止电泳。

　　1.2.6 考马斯亮蓝染色 按常规方法进行。

　　1.2.7 凝胶成像及双向电泳图谱分析

　　将染色后的凝胶置ChemiDoc XRS凝胶成像系统(BioRad)中照相成像。采用ImageMaster 2D Platinum(Amersham)双向电泳图谱分析软件进行斑点自动识别、定量检测及匹配对比分析。获得各蛋白斑点的实验等电点（pI）和分子量（MW），结合组织表达特异性，采用TagIdent工具软件检索SWISSPROT蛋白数据库，对蛋白斑点进行初步鉴定。

　　1.3 统计学分析

　　数据用x±s表示，组间比较采用t检验。采用SPSS11.0统计软件分析处理数据。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠糖尿病模型的建立

　　经注射STZ造模后，大鼠尿量、食量、饮水明显增加，体重明显减轻，餐后血糖浓度明显增高，而血清胰岛素浓度明显降低，说明大鼠糖尿病模型造模成功。正常对照组及糖尿病模型组CCK8刺激前后大鼠血糖及血清胰岛素浓度的变化。见表1。表1 CCK8刺激前后餐后血糖和血清胰岛素的变化(略)

　　2.2 大鼠胰腺组织蛋白质组的双向电泳

　　分别提取正常对照组及糖尿病模型组CCK8刺激前后大鼠胰腺组织蛋白质组进行双向电泳并经考马斯亮蓝染色，所获得的典型的双向电泳图谱。经ImageMaster 2D Platinum分析软件进行斑点自动识别和检测，在pI 3.0～10.0，MW 19.7～174.4 kD的范围内，共检出蛋白质斑点226个(“+”标示)。见图1。

　　2.3 典型蛋白质斑点的初步确定

　　选取具有表达差异的蛋白质斑点(即斑点的相对总灰度值%Vol≥1.0倍)，根据其实验pI值和MW，结合其组织表达特异性，匹配检索SWISSPROT数据库(http://www.expasy.org/)及SOURCE组织细胞表达数据库(http://smd.stanford.edu/cgibin/source/sourceSearch)，初步确定了与CCK8刺激大鼠糖尿病模型组相关的5种蛋白质。见图1，表2。表2 初步确定的CCK8刺激大鼠糖尿病模型组表达增高的蛋白质(略)

　　3 讨 论

　　STZ对一定种属动物的胰岛β细胞具有选择性的破坏作用，从而使许多动物产生糖尿病。本研究采用注射STZ人工造模的方法，获得了大鼠糖尿病模型。经大鼠血糖及血清胰岛素浓度测定，餐后血糖浓度增高而血清胰岛素浓度降低，证实造模成功。给予CCK8刺激后，虽然血糖浓度改变不大，但血清胰岛素浓度有轻微升高趋势，说明CCK8可能对受损胰岛细胞有一定的保护和恢复作用。

　　为了进一步从分子水平上观察CCK8对受损胰岛细胞的保护和恢复作用，本实验采用外源性给予糖尿病大鼠模型CCK8，2 d后取胰腺组织进行双向电泳，并与蛋白质生物信息数据库及组织细胞特异表达数据库进行匹配分析，初步确定了5个在CCK8刺激前后存在明显表达差异的蛋白质，即cJun氨基末端激酶作用蛋白1(JIP1)、组蛋白结合蛋白RBBP7(RBBP7)、丝/苏蛋白磷酸酶2A催化亚基β亚型(PP2AB)、胰腺/十二指肠同源盒蛋白1(PDX1)和凋亡调节蛋白BclX(beta)(BCLX)。

　　JIP1是一种在胰岛β细胞中特异表达的蛋白质，具有选择性调节JNK和MAPK信号转导途径，直接或间接地调控GLUT2基因表达和β细胞的生理功能，并且作为抗凋亡蛋白，调节胰岛β细胞的凋亡和存活〔6，7〕。BCLX也是一种分布广泛的凋亡调节蛋白，具有抑制细胞凋亡的作用。RBBP7(RbAp46)在胰腺中高表达，具有调节组蛋白乙酰转移酶和去乙酰转移酶组蛋白底物，不同程度调节染色质代谢复合物组件，促进组蛋白脱乙酰作用和转录抑制的组蛋白脱乙酰核复合物，促进基因表达和蛋白质合成，促进细胞生理功能的恢复〔8〕。PP2AB大部分分布于胰腺，能调节CCK受体的敏感性〔9〕，以及磷酸化激酶B、酪蛋白激酶2、促有丝分裂S6激酶和MAP2等信号转导相关蛋白激酶或蛋白磷酸酶的活性，从而对相应的信号转导通路产生影响〔10〕。PDX1是一种特异地分布于胰腺和十二指肠的基因表达调节蛋白，能结合DNA 序列5′CC〔CT〕TAATGGG3′，启动胰岛素基因的表达，是激活胰岛和胃肠道肽类激素表达的关键调节蛋白〔11，12〕。已观察到CCK8和胃泌素能通过作用于CCKB受体而促进PDX1的表达〔5〕。因此，CCK8对胰岛细胞的保护或恢复作用，可能是通过促进特异性蛋白质表达增强，进而促进DNA复制、蛋白质表达及细胞增殖；抑制胰岛细胞凋亡；调节基因表达，特别是胰岛素基因的表达，增加肽类激素的合成等方面来发挥其作用的。这一发现为临床联合应用CCK8治疗2型糖尿病提供了新的实验依据。

　　本研究通过双向电泳及生物信息学分析，初步确定了5种与CCK8刺激糖尿病大鼠胰岛细胞损伤保护相关的蛋白质，但这些蛋白质的进一步确证尚需采用Western印迹和质谱分析等技术方法加以鉴定。

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