重组Psilencer1.0U6siRNAstat3质粒对体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞的影响

【摘要】 目的 观察重组Psilencer1.0U6siRNAstat3质粒对大鼠主动脉平滑肌细胞(RSMCs)的抗增殖作用机制。方法 应用组织块方法培养RSMCs，应用脂质体转染方法将重组Psilencer1.0U6siRNAstat3质粒转染体外培养的RSMCs，利用相差显微镜、MTT比色法观察体外培养的RSMCs增殖情况。结果 培养72 h后，相差显微镜下观察可见重组质粒组细胞增殖明显减少，MTT检测可见重组质粒组RSMCs的抑制率明显高于对照组。结论 重组Psilencer1.0U6siRNAstat3质粒能够抑制RSMCs增殖。

【关键词】 主动脉平滑肌细胞；STAT3；重组Psilencer1.0U6siRNAstat3质粒

血管平滑肌细胞(VSMC)向内膜层的迁移和增殖是近年来血管增殖性疾病的研究热点和防治难点〔1〕。研究发现，平滑肌细胞表型的改变（由收缩型变成分泌型）使得平滑肌细胞获得了增殖和迁移的能力，造成了移植或损伤后血管内膜的增生，从而造成血管的再狭窄〔2〕。有观点认为，平滑肌细胞的增殖和转移是由细胞内信号传导途径调节的〔3，4〕。转录信号传导子及激活子通路（STAT3）代表一条从膜到核的信号传导系统，激活后可以选择性地激活其底物——STAT，并相应的激活Cyclin D1、BclxL及Cmyc等下游靶基因，调节细胞增殖、分化及凋亡，可能在促进VSMC增殖进程中起重要的作用〔5〕。

　　 Psilencer1.0U6siRNAstat3是通过RNA干扰技术建立的能够抑制STAT3表达的重组质粒，能使STAT3基因片段的转录、翻译过程受到抑制，从而阻断其对下游靶基因的作用，由此达到对细胞增殖的控制。本实验将该质粒通过脂质体转染的方法作用于体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞（RSMCs），应用相差显微镜、MTT比色法等技术手段对其观察，希望通过研究STAT信号通路与RSMCs的关系，为揭示血管新生内膜形成、血管重塑等病理机制提供新的思路和方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂 Lipofectamine2000（Invitrogen）、Trizol（Invitrogen）、胰蛋白酶(美国GIBCOBRL公司)、胎牛血清(BSA，美国HyClone公司) 、DMEM培养基、MTT、DMSO。

　　1.2 大鼠原代RSMCs的培养与分离 应用组织块培养方法培养原代RSMCs：大鼠150～180 g，脱臼致死，固定。消毒胸腹部，剪切开胸腹部，分离胸腹主动脉并放入盛有Hank′s液的细胞培养皿中，眼科镊去除血凝块和血管外膜层。放入另一含20%胎牛血清Hank′s液的细胞培养皿中，剪开血管腔，以眼科弯镊轻轻擦拭去掉内膜层内皮细胞。放入另一含20%胎牛血清的DMEM中，用眼科弯剪剪碎血管组织至1 mm，把组织块转入玻璃培养皿中，均匀贴壁，组织块的间距为0.5 cm。盖好瓶盖，瓶底朝上，向瓶内注入适量培养液，于37℃孵箱内放置4～5 h，使组织块干涸，并与瓶底贴附。将培养瓶慢慢翻转平放，使组织块完全浸入培养液中，继续静置3～5 d。待有细胞从组织块周围游离出后换液。待大部分组织块长出细胞晕，并与相邻细胞晕接触时就可以传代，实验用第5代细胞。分为对照组、空质粒组和重组质粒（Psilencer1.0U6siRNAstat3）组。

　　1.3 MTT比色法检测重组质粒对RSMCs增殖率的影响 取对数生长期RSMCs，胰酶消化后，无血清培养基调制细胞浓度为2×105/ml接种于96孔平底培养板，每孔100 μl (2×104/孔)。将其分为3组，分别为对照组、空质粒组、重组质粒组。对照组不加质粒和脂质体，空质粒组每孔添加空质粒0.2 μg、质粒0.5 μl，重组质粒组每孔添加重组Psilencer 1.0U6siRNAstat3质粒0.2 μg、脂质体0.5 μl，均培养至48 h及72 h，在相差显微镜下观察拍照后，各孔加入浓度为5 g/L MTT(用PBS新鲜配制)20 μl，温箱孵育4 h，轻轻吸去上清，每孔加入DMSO 100 μl，震荡10 min，用酶标仪检测各孔的吸光度值（OD570），计算细胞的生长抑制率。
　　
　　细胞生长抑制率（%）=（1-实验组/对照组）×100%

　　1.4 RSMCs相差显微镜观察 转染完成后相差显微镜下观察48 h及72 h各组RSMCs形态。并比较其差别。

　　1.5 统计学处理 组间比较采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 RSMCs相差显微镜观察结果 48 h后对照组细胞贴壁生长，状况良好，呈梭形、不规则三角形或扇形，核仁清晰，可见核分裂相，细胞折光性好，增殖旺盛，细胞间相互融合，呈“铺路石”样；重组质粒组细胞生长缓慢，可见卵圆形，细胞皱缩；部分细胞失去原有形态，细胞数目较对照组明显减少，折光性差。见图1。72 h后对照组细胞增殖较48 h组明显，但重组质粒组生长更加缓慢，细胞失去原有形态，细胞核固缩，细胞数目较对照组减少更加明显，并有部分细胞漂浮在培养液中。见图2。

　　图1 培养48 h后RSMCs形态(×200)（略）

　　图2 培养72 h后平滑肌细胞形态(×200)（略）

　　图3 不同时间各组平滑肌细胞数的比较（略）

　　2.2 MTT实验检测各组质粒对RSMCs增殖的抑制结果 转染48及72 h，对照组、空质粒组及重组质粒组的抑制率分别为：17%及12%，21%及16%，42%及51%。与对照组及空质粒组相比，重组质粒组对RSMCs增殖的抑制作用明显增强（P<0.05），而对照组与空质粒组则无明显区别。见图3。

　　3 讨论
　　
　　血管旁路移植手术是治疗冠心病和远端缺血性疾病的常用手段，但是由于内膜增生形成移植血管再狭窄，从而造成远期通畅率降低。普遍认为，不同的刺激和损伤造成的平滑肌细胞在内膜积聚是造成内膜增生的主要原因〔6〕。内膜细胞对细胞内信号途径的反应可能导致平滑肌细胞向内膜的进一步迁移和积聚，而STAT3通路可能是其中造成内膜增生的一个重要的细胞内信号途径。
　　
　　STAT3通路是否介导了重组Psilencer1.0U6siRNAstat3质粒对VSMCs作用呢?本实验通过相差显微镜观察可见，RSMCs在重组质粒作用后，细胞形态和数量发生了明显改变。与对照组相比，重组质粒组细胞数量明显减少，细胞形态单一，呈现皱缩现象，核仁显示不清。MTT方法结果显示，加入重组Psilencer1.0U6siRNAstat3质粒后RSMCs的增殖活性减低并呈现时间依赖性。
　　
　　综上所述，重组Psilencer1.0U6siRNAstat3质粒能够抑制RSMCs增殖。Shibata证实VSMC中，STAT3通过直接对早期反应基因的转录激活，从而调控增殖信号的传递〔7〕。本实验中，该质粒抑制RSMCs增殖的细胞内信号转导机制可能就是通过STAT3信号传导通路形成的，该质粒通过抑制STAT3信号通路，尤其是抑制STAT3的磷酸化活性，进而影响了RSMCs增殖信号的传递，使其影响了下游靶基因的转录及蛋白表达水平，从而使RSMCs的增殖受到抑制。该实验为扩大该质粒的临床应用适应证及防治冠状动脉旁路移植术后再狭窄提供了一定的实验基础和理论依据。

参考文献

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　　2 Owens GK.Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease〔J〕.Physiol Rev，2004；84(3)：767801.

　　3 Davies MG，Hagen PO.Pathophysiology of vein graft failure：a revie〔J〕. Eur J Vasc Endovasc Surg，1995；9(1)：718.

　　4 Lemson MS.Intimal hyperplasia in vascular grafts〔J〕.Eur J Vasc Endovasc Surg，2000；19(4)：33650.

　　5 唐 梅.JAK/STAT信号通路调控血管平滑肌细胞病理生理功能的分子机制〔J〕.国际心血管病杂志，2006；33：24951.

　　6 Schwartz SM.The intimal soil for atherosclerosis and restenosis〔J〕. Circ Res，1995；77(3):44565.

　　7 Shibata R，Kai H，Seki Y，et al.Inhibition of STAT3 prevents neointima formation by inhibiting proliferation and promoting apoptosis of neointimal smooth muscle cells〔J〕.Hum Gene Ther，2003；14(7):60110.