苦参碱诱导人前列腺癌pc3m细胞凋亡及对骨桥蛋白表达的影响

　　　　 作者：金光虎 高吉 毛小强 赵锐 孔祥波

【摘要】 目的 探讨苦参碱治疗前列腺癌的可行性及机制。方法 将一定浓度梯度的苦参碱与人前列腺癌细胞株pc3m孵育后，采用MTT法及流式细胞仪检测细胞增殖与凋亡变化，逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测pc3m中骨桥蛋白基因(OPN mRNA)表达水平。结果 苦参碱作用后pc3m生长明显受抑，且呈时间浓度依赖性;在流式细胞仪上可见凋亡率增加;pc3m细胞中OPN mRNA表达阳性，OPN mRNA表达水平明显下调。结论 苦参碱体外能有效抑制pc3m生长，其机制可能与诱导细胞凋亡、下调OPN mRNA表达有关。

【关键词】 苦参碱;前列腺癌细胞，凋亡;骨桥蛋白;肿瘤转移

骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)是近年来发现的一种分泌型磷酸化糖蛋白，参与骨代谢、动脉硬化及抗感染免疫反应等过程〔1〕，近年来的研究表明，OPN的表达与肿瘤的生长与转移有关〔2〕。苦参碱是从我国传统中药苦参中提取出的一种生物碱活性成分，具有广泛的药理学作用。近年来，苦参碱对于其他肿瘤细胞作用的研究报道日见增多，其体内外的抗肿瘤活性受到极大关注。我们观察了苦参碱诱导人前列腺癌pc3m细胞凋亡及对OPN表达的影响，探讨苦参碱用于前列腺癌治疗的可行性及机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　前列腺癌细胞株pc3m由吉林大学基础医学院病理学教研室惠赠。苦参碱注射液(云南白云山药业有限公司)。RPMI1640培养基(GIBCO公司);小牛血清(天津灏洋)；噻唑蓝(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)(北京博奥森);RTPCR扩增试剂盒(TAKARA公司);OPN、三磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH)引物(上海生物工程技术公司合成)；Trizol Reagent(晶美生物)；Annexin VFITC细胞凋亡检测试剂盒(凯基生物)。酶标仪(日本);SWCJ1F超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；CO2孵箱(三洋公司)，FACScan型流式细胞仪(FCM，美国Becton Dickinson公司)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 细胞培养

　　将pc3m置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，37℃、体积分数5% CO2饱和湿度培养箱培养，细胞呈单层贴壁生长后取对数生长期细胞用于实验。

　　1.2.2 细胞抑制率检测

　　采用MTT法。取生长良好的pc3m细胞，调整细胞浓度至1～2×104个/ml接种于96孔培养板内，待细胞贴壁后实验组分别加入0.125、0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mg/ml的苦参碱，空白对照组不加药物。每组设3个复孔，放入CO2培养箱内培养24 h，然后每孔加MTT溶液20 μl(5 mg/ml)，再培养4 h，弃上清，每孔加入100 μl DMSO振荡，使结晶完全溶解，在全自动酶标仪上比色，空孔对照调零于酶标仪上测定吸光度值(A值)，计算不同浓度苦参碱作用后细胞生长抑制率，实验重复3次，取3次平均值。细胞生长抑制率(%) =(对照组A值-加药组A值) /对照组A值×100%。

　　1.2.3 细胞凋亡率检测

　　以不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化收集经过不同浓度苦参碱处理的pc3m细胞1～2×106，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次（2 000 r/min，5 min），加入500 μl的binding Buffer悬浮细胞，加入5 μl Annexin VFITC混匀后加入5 μl PI混匀，室温避光反应5～10 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

　　1.2.4 细胞OPN mRNA表达检测

　　采用RTPCR方法。

　　1.2.4.1 组织总RNA抽提和cDNA合成

　　用Trizol一步法提取总RNA，UV2201型紫外分光光度计上测定OD260和OD280，换算pc3m细胞中总RNA纯度和浓度，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。实验组与对照组分别取2μg总RNA，采用RTPCR扩增试剂盒，合成cDNA模版。

　　1.2.4.2 PCR

　　各样品分别取1 μl逆转录产物进行PCR。加入目的基因OPN引物。OPN上游引物5′CCCTTCCAAGTAAGTCCAACGAAAGCC 3′;下游引物:5′GCTGACTCGTTTCAT
AACTGTCCTTCCC3′;预计扩增片段长度470 bp。PCR扩增条件为：94.0℃ 2 min，94.0℃ 30 s、60.0℃ 15 s、72℃ 30 s共32个循环，72℃ 10 min，扩增产物加入1.5%琼脂糖凝胶中，以120 V/cm电泳30 min后，在320 nm紫外透射仪下观察相应的目的基因的扩增条带。

　　1.3 统计学方法

　　采用SPSS12.0统计软件，结果以x±s表示。采用方差分析和t检验。

　　2 结 果

　　2.1 细胞抑制率

　　苦参碱0.125、0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mg/ml组细胞增殖抑制率分别为1.68%、4.45%、27.17%、66.07%、97.42%和98.18%。随苦参碱作用浓度的增加，细胞增殖逐渐减慢。苦参碱对细胞增殖的抑制率随药物浓度的增高而增大，二者呈正相关关系(r=0.764，P＜0.05)。经分析，其IC50为0.87 mg/L。据此在后续实验中将苦参碱实验组分为1.0及2.0 mg/L组。

　　2.2 细胞凋亡率及死亡率

　　阴性对照组、苦参碱1.0 mg/L组及苦参碱2.0 mg/L组凋亡率分别为6.3%、7.9%及11.0%。死亡率为5.3%、5.4%及12.8%，经过不同浓度药物处理后凋亡率及死亡率呈上升趋势。重复实验显示类似结果。见图1。

　　2.3 细胞OPN mRNA表达

　　半定量RTPCR结果以琼脂糖凝胶电泳条带的亮度来判断OPN的mRNA表达高低，OPN扩增片断为470 bp，结果显示苦参碱1.0 mg/L组细胞及苦参碱2.0 mg/L组细胞相对与阴性对照组细胞来说mRNA的表达量分别下降了33.14%和62.1%，其中以苦参碱2.0 mg/L组细胞的OPN mRNA抑制较为明显。见图2。

　　3 讨 论

　　近几年苦参碱成为抗肿瘤药物研究的一个新热点。就目前的研究结果来看，苦参碱抗肿瘤的作用是全面而广泛的，包括〔3〕①抗肿瘤增殖，②诱导分化和凋亡，③抗肿瘤浸润和远处转移，④抑制肿瘤新生血管形成，⑤减轻致肿瘤炎症和抑制肿瘤耐药性，⑥减低化疗不良作用，⑦增强肿瘤宿主免疫功能，肿瘤预防性化疗等多个方面。本研究观察了苦参碱诱导人前列腺癌pc3m细胞凋亡及对OPN表达的影响，探讨苦参碱用于前列腺癌治疗的可行性及机制。结果显示，苦参碱在体外可抑制pc3m细胞的生长，且抑制作用具有明显的时间和浓度依赖性;通过流式细胞仪测细胞凋亡率见随着药物浓度增加细胞凋亡率明显增加。

　　晚期前列腺癌经激素阻断治疗后多数出现肿瘤的萎缩，但由于激素非依赖性克隆的生长，最终出现肿瘤的扩散、转移，骨转移是晚期前列腺癌最常见的转移部位，研究表明〔4，5〕在适当的宿主激素环境中，骨成纤维细胞可诱导激素依赖性前列腺癌细胞向激素非依赖性前列腺癌细胞转化，并表现为具有骨转移的恶性潜能，这一过程依赖于骨成纤维细胞所产生的细胞外基质及生长因子的作用。细胞外基质在肿瘤细胞的生长、黏附以及转移过程中起重要的作用，其中骨基质蛋白可能对前列腺癌细胞的生物学特性具有重要的影响。骨基质蛋白并不仅仅局限在骨组织表达，OPN作为一种非胶原性骨基质蛋白，通过其受体整合素和CD44等与细胞的趋化、黏附和迁移，抑制凋亡以及肿瘤细胞不依赖锚定的生长等密切相关，在多种肿瘤转移的过程中发挥重要作用〔6～8〕。武玉东等〔9〕报道OPN mRNA在前列腺癌组织中有高水平表达，而在前列腺增生及正常前列腺组织中均未见阳性表达，提示OPN可能在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。本实验结果表明OPN mRNA在前列腺癌pc3m细胞中高表达，经不同浓度苦参碱处理后表达明显减少，其中以2.0 mg/L苦参碱抑制作用最为显著，提示苦参碱可通过抑制OPN表达而影响前列腺癌的复发与转移。
　　

参考文献

　1 Standal T，Borset M，Sundan A.Role of osteopontin in adhesion，migration，cell survival and bone remodeling〔J〕.Exp Oncol，2004；26(3)：17.

　　2 Wai PY，Kuo PC.The role of osteopontin in tumormetastasis〔J〕.J Surg Res，2004；121(2)：22.

　　3 张鸣杰，黄 建.苦参碱类抗肿瘤作用机制研究的新进展〔J〕.中国中药杂志，2004；29（2）：114.

　　4 Wu HC，Hsieh JT，Gleave ME，et al.Derivation of androgenindependent human LNCaP prostatic cancer cell sublines：role of bone stromal cells〔J〕.Int J Cancer，1994；57(3)：406.

　　5 Gleave ME，Hsieh JT，Gao CA，et al.Acceleration ofhuman prostate cancer growth in vivo by factors produced by prostate and bone fibroblasts〔J〕. Cancer Res，1991；51(14)：753.

　　6 Koopmann J，FedarkoNS，Jain A，et al.Evaluation of osteopontin as biomarker forpancreatic adenocarcinoma〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2004；13(3)：487.

　　7 Schneider S，Yochim J，Brabender J，et al.Osteopontin but not osteonectin messenger RNA expression is a prognostic marker in curatively resected nonsmall cell lung cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2004；10(5):588.

　　8 武玉东，刘秉乾，张雪培，等.前列腺癌组织中骨桥蛋白及基质金属蛋白酶2检测〔J〕.郑州大学学报（医学版），2004；40（4）：6546.