动脉粥样硬化形成过程中内源性一氧化碳和一氧化氮的变化及其相互关系

【摘要】 目的 研究食饵性动脉粥样硬化(AS)形成过程中，主动脉内源性一氧化氮(NO)及一氧化碳(CO)的变化、相互关系及对AS进程的影响。方法 家兔予以高胆固醇饮食(胆固醇组，n=8)，同时经腹腔注射氯化血红素(血红素组，n=8)或锌原卟啉9(卟啉锌组，n=8)，或经饮水给予L精氨酸(精氨酸组，n=8)或亚硝基L甲酯(亚硝基组，n=8)，共12 w。结果 高胆固醇饮食显著升高血清脂质〔总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、氧化型LDL(oxLDL)〕水平，与对照组比较，胆固醇组主动脉NO生成量及NO合成酶(cNOS)活性明显降低，CO生成量及HO活性明显增加(均P<0.01)，主动脉斑块面积为(54.00±4.16)%。与胆固醇组比较，氯化血红素显著增加HO活性及CO生成量，主动脉斑块面积仅(17.88±3.01)%(均P<0.01)；卟啉锌显著降低HO活性及CO生成量，主动脉斑块面积高达(61.13±3.50)%(均P<0.01)；L精氨酸显著增加cNOS活性及NO生成量，主动脉斑块面积仅(18.57±3.49)%(均P<0.01)；亚硝基L精氨酸甲酯显著降低cNOS活性及NO生成量，主动脉斑块面积高达(56.72±3.66)%(均P<0.01)。结论 高胆固醇饮食诱导的AS使主动脉NOS/NO系统显著受损，HO/CO与NOS/NO两系统显示互补及代偿性调节作用，HO/CO系统通过对NOS及NO的调节和代偿从而抑制AS进展。

【关键词】 动脉粥样硬化；内源性一氧化氮；内源性一氧化碳;血红素氧合酶;一氧化氮合酶(脱环)

　　【Abstract】 Objective To study the change of endogenous carbon monoxide (CO) and nitric oxide (NO) in rabbit aorta with atherosclerosis(AS) induced by high cholesterol diet and the inffluence of CO and NO on AS process. Methods The rabbits were given 1.5% cholesterol diet (Ch group) or 1.5% cholesterol diet plus hemin (15 mg·kg-1·ｄ-1， ip.， Hm group) or zincprotoporphyrin IX (ZnppIX， 45 μmol·kg-1·ｄ-1， ip.， Zn group) or Larginine(2.25% in drinking water， Arg group) or Lnitroarginine methylester(0.12% in drinking water， LNAME group)， each group had 8 rabbits. After 12 w， the levels of serum lipids(TC， TG， LDLC， HDLC， oxLDL) and the contents of aortic CO and NO，NO synthases(cNOS) and heme oxygenase(HO) activity were assessed， the aortic AS was measured by image analyse system. Results High cholesterol diet markedly enhanced the levels of serum TC，TG， LDLC and oxLDL(all P＜0.01).Compared with those of control group， the contents of aortic NO and cNOS were decreased markedly， the content of CO and the activity of HO were increased markedly(all P＜0.01) in Ch group， and the aortic plaques area was (54.00±4.16)%. Hemin injection increased markedly the activities of aortic HO and CO， the aortic plaques area was (17.88±3.01)%. ZnppIX injection made the opposite results， the aortic plaques area was (61.13±3.50)%. Larginine increased markedly the activities of aortic cNOS and CO， the aortic plaques area was (18.57±3.49)%， LNAME made the opposite results， the aortic plaques area was (56.72±3.66)%. Conclusions Aortic NOS/NO system are impaired significantly in AS rabbits.The reciprocal correlation of HO/CO and NOS/NO systems in AS could play the protective role against AS lesion.

　　【Key words】 Atherosclerosis; Endogenous nitric oxide; Endogenous carbon monoxide; Heme oxygenase; Nitricoxide synthase

　　内源性一氧化碳(CO)被认为是一种新型信使分子，由血红素氧合酶(heme oxygenase，HO)氧化分解血红素而产生。目前发现三种HO，HO1为诱导型，HO2和HO3为结构型。一氧化氮(NO)是体内最重要的气体信使分子，由一氧化氮合酶(NOsynthase，NOS)以Ｌ精氨酸为底物合成。NOS分为结构型(cNOS)及诱导型(iNOS)。HO1和iNOS在许多器官和组织中都能被诱生，它们的诱生包括基因激活和酶蛋白合成。CO与NO有相似的心血管作用，能激活可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)，舒张血管平滑肌、抑制血小板聚集和血管平滑肌细胞（VSMC）增殖〔1〕。然而，在动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)进程中主动脉HO/CO、NOS/NO系统的作用及相互关系欠清楚。本研究在高胆固醇饮食诱导的兔AS模型上，干预NOS、HO1的活性，检测主动脉NOS、HO活性及NO、CO生成量的变化，旨在探讨AS进程中HO/CO、NOS/NO系统的变化、作用及其相互关系，从而为AS等心血管疾病防治提供新思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物分组及实验
　　　
　　48只新西兰大白兔，体重1.6～2.0 kg，由新桥医院动物研究中心提供，适应性饲养1 w后进入实验。随机分为6组(各组8只)：对照组：喂饲普通饲料；胆固醇组：喂饲含1.5%胆固醇饲料；卟啉锌组及血红素组：在予以高胆固醇饮食的同时，分别经腹腔注射氯化血红素(15 mg·kg-1·d-1)或锌原卟啉9(45 μmol·kg-1·d-1)；精氨酸组及亚硝基组：高胆固醇饮食的同时饮水给予L精氨酸(2.25 g/d)或亚硝基L精氨酸甲酯(LNAME，120 mg/d)，共12 w。

　　1.2 血液生化测定

　　禁食12 h后经耳缘静脉取血，采用酶法测定血清脂质〔总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）〕，试剂盒由上海科华生物技术有限公司提供；采用双抗体夹心法测定氧化型LDL(oxLDL)，试剂盒由上海荣盛生物试剂厂提供。

　　1.3 主动脉NO及CO生成量测定

　　按Greiss法〔2〕测定主动脉孵育液中亚硝酸盐(NO-2)含量代表NO的生成量；主动脉CO生成量测定参照Morita等〔3〕方法。

　　1.4 主动脉NOS及HO活性测定

　　主动脉NOS活性采用3H精氨酸转化生成3H胍氨酸测定法〔4〕；主动脉HO活性参照文献〔5〕测定。

　　1.5 主动脉斑块面积测定

　　腹主动脉经10％中性缓冲福尔马林钙液固定、常规脱水后用油红Ｏ染色(斑块部位着红色)，然后用Leica Qwin图像分析软件测量斑块面积和主动脉内膜面积，计算斑块占主动脉内膜面积的百分比。

　　1.6 统计学处理

　　数据以x±s表示，两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 血液生化结果

　　与对照组比较，实验结束时，高胆固醇饮食各组血清TC、TG、 LDLC和oxLDL水平均显著升高(P<0.01)，HDLC水平升高不显著(P>0.05)。血清TC、TG、LDLC和oxLDL水平在胆固醇组、卟啉锌组、血红素组、精氨酸组及亚硝基组之间均无显著性差异。见表1。

　　2.2 主动脉NO、CO生成量及NOS、HO活性

　　与对照组比较，胆固醇组主动脉NO生成量减少27%，CO生成量增加55%，cNOS活性降低44%，HO活性升高79%，iNOS活性升高48%(均P<0.01)；卟啉锌组NO、CO生成量分别减少26%、54%，cNOS、HO活性分别降低44%、32%，iNOS活性升高74%(均P<0.01)；亚硝基组NO生成量减少50%，CO生成量增加84%，cNOS活性降低59%，HO活性升高86%，iNOS活性降低26%(均P<0.01)。与胆固醇组比较，血红素组HO活性及CO生成量明显增加，iNOS活性明显降低(均P<0.01)，NO生成量及cNOS活性在两组间差异无显著性；卟啉锌组CO生成量及HO活性明显降低，iNOS活性明显增加(均P<0.01)，NO生成量及cNOS活性在两组间差异无显著性；精氨酸组NO生成量及cNOS活性明显增加(均P<0.01)，而iNOS、HO活性及CO生成量在两组间差异无显著性；亚硝基组NO生成量及cNOS、iNOS活性明显降低，而HO活性及CO生成量明显增加(均P<0.01)。见表2。

　　2.3 主动脉内膜斑块面积

　　对照组家兔主动脉内膜无粥样斑块形成，胆固醇组斑块面积为(54.00±4.16)%，血红素组为(17.88±3.01)%，卟啉锌组达(61.13±3.50)%，精氨酸组为(18.57±3.49)%，亚硝基组达(56.72±3.66)%。与胆固醇组比较，精氨酸组及血红素组斑块面积均明显减小(均P<0.01)，卟啉锌组斑块面积明显增大(均P<0.01)，亚硝基组斑块面积增大无统计学意义。表1 血清脂质、oxLDL测定结果(略)表2 主动脉HO活性、CO生成量及NOS活性、NO生成量测定值(略)

　　3 讨 论

　　AS的主要病理改变是内皮细胞受损，VSMCs增殖及脂质沉积，引起管腔狭窄及内皮舒张因子产生减少，血管张力增加。研究表明〔6，7〕，血管内皮不仅有NO依赖性血管舒张作用，还有NO非依赖性血管舒张途径，内源性CO就是NO非依赖性血管舒张因子，在维持血管正常生理功能方面，两者具有互补或也可能是等同的生理作用。由于NO与cGMP的亲和力比CO强50倍，因此在生理状态下NO起主要作用。在AS病变发展过程中，内皮功能受损，内皮源性cNOS表达或活性下降，内皮源性NO产生减少，而VSMCs表达的iNOS活性增加，产生大量NO自由基，刺激细胞凋亡和胶原组织降解，促进AS的形成〔8〕，NO自由基还可与超氧阴离子反应形成过氧化亚硝酸盐，引起组织损伤。在AS形成中，HO1诱导性表达，CO产生增加，一方面，可抑制iNOS的活性及产生，减少组织损伤。其可能机制为：①iNOS是一种细胞色素P450型血红蛋白，P450是HO1的底物，HO1的活性增加能加速iNOS的降解；②iNOS活性位点需要2个血红素分子，HO1的活性增加能加速血红素的降解，减少iNOS的合成；③CO能与iNOS结合，使之失活〔9〕；④血红素分解过程中释放的游离铁能通过抑制核转录进一步抑制iNOS的产生。另一方面，CO产生增加能增高cGMP水平，舒张血管，代偿内皮源性cNOS产生NO的功能不足，这在病理状态下cNOS表达或活性下降时具有重要意义。

　　LDL水平增高是AS的主要危险因素，氧化成oxLDL后能直接降解和灭活NO，中断NO的受体后信号传导，引起局部血管收缩、VSMCs增殖、血小板黏附聚集、内皮功能障碍，促进动脉血栓形成，导致管腔狭窄〔10〕。本研究显示，高胆固醇饮食诱导家兔血清TC、TG、LDLC、oxLDL明显升高，然而在5个实验组之间并无显著性差异，表明氯化血红素和L精氨酸未降低血清脂质、oxLDL水平，HO/CO与NOS/NO系统对AS形成的影响可能并非通过调节血脂代谢实现，同时亦提示AS是多重危险因素或病因形成的病理改变。本研究结果也显示，高胆固醇饮食诱导的AS家兔主动脉NO生成量显著减少，cNOS活性显著降低，这可能与LDL及oxLDL的显著升高有关，口服Ｌ精氨酸增高了cNOS活性，增加了主动脉NO的生成量，从而抑制了AS进展。

　　AS的主动脉cNOS活性显著降低，NO生成量显著减少，同时HO活性升高，CO生成量增加，主动脉斑块面积明显小于卟啉锌组，表明AS时NOS/NO系统严重受损，HO/CO系统具有代偿性保护作用。NOS抑制剂亚硝基L精氨酸甲酯使NOS活性、NO生成量显著低于其他组，而HO活性、CO生成量显著增加，从而使该组主动脉斑块面积与胆固醇组无统计学差异，进一步显示HO/CO系统能够部分代偿cNOS产生NO的功能不足。相反，HO抑制剂锌原卟啉9使HO/CO系统代偿作用减弱，HO活性、CO生成量明显降低，而iNOS活性明显升高，主动脉斑块面积则最大。本研究表明，NOS/NO、HO/CO两系统在AS进程中具有相互调节及互补作用，HO/CO系统通过对NOS及NO的调节和代偿作用抑制AS进展，同时也表明，在AS等病理状态下，HO/CO系统的作用可能更有意义。

　　多项研究显示〔3，11〕，内源性CO可显著抑制VSMCs增殖。本文前期的研究也表明，内源性CO可抑制oxLDL、IGF1诱导的VSMCs增殖〔12，13〕。CO还能通过增加血小板内鸟苷酸环化酶（sGC）的活性，抑制血小板聚集，防止血栓形成〔14〕。本研究应用HO的底物和激动剂氯化血红素后，HO活性显著升高，CO生成量显著增加，主动脉斑块面积显著减小，抑制了AS进展。由于氯化血红素促进并维持主动脉内HO1活性持续升高，内源性CO的产生增加，循环系统中cGMP水平升高，增加代偿极限，所以能减轻病变，延缓AS的进程。

　　综上所述，①内源性NO和CO均具有抗AS作用，这种作用可能并非通过其对血脂、ox LDL的调节来实现；②通过血红素干预食饵性兔AS斑块使HO1活性及蛋白表达增加，内源性CO浓度亦随之升高，VSMCs增殖受抑，显示出有效的抗AS作用;③AS进程中，HO/CO系统和NOS/NO系统显示出互补及代偿性调节作用。

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