突变型人APP基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合载体的构建

　　　　　　作者：张丽娟 王凤斌 成敏 刘蓉

【摘要】 目的 构建携带突变型人淀粉样前体蛋白基因(APP695)与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因融合载体。方法 在NCBI上查找APP695的序列，设计引物。以pCB6质粒携带的野生型APP695序列为模板，以突变体引物扩增突变型APP695。 将突变型APP695与pIRES2EGFP连接并测序证实。结果 经过酶切鉴定、PCR和DNA测序等方法，证实构建的pIRES2EGFP/APP695突变型质粒载体序列正确。结论 成功构建APP695EGFP融合基因载体，为研究AD发病的分子机制和治疗时的药物筛选奠定基础。

【关键词】 瑞典突变APP695；增强型绿色荧光蛋白；APP695EGFP融合基因；载体

　　【Abstract】 Objective To construct and express a recombinant vector bearing fusion gene of human amyloid precursor protein (APP)695 mutant gene and enhanced fluorescence protein (EGFP) fusion gene. Methods The primers were designed according to the sequences of APP695 gene found from NCBI. Then the mutant APP695 was amplifed by PCR with pCB6 carrying wild human APP695 and acting as a template， the gene of mutant APP695 was ligated to pIRES2EGFP .The recombinant plasmid of pIRES2EGFP/APP695 mutant was verfied by checking sequences. Results The exact sequences of pIRES2EGFP/APP695 mutant vector were confirmed by digestion of restriction endonucleases， PCR and sequencing. Conclusions The pIRES2EGFPAPP695 mutant fusion gene recombination has been constructed successfully， which lays the foundation for further research of AD pathogenesis and screening new drug targets on AD therapy.

　　【Key words】 Swedish mutant APP695；EGFP；Fusion gene of human APP695/ EGFP ; Vector

　　淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)基因是Alzheimer病(AD)已发现的诸多相关基因之一。 APP基因某些位点的突变可以引发某些家族的早发性AD，故APP的突变在AD发病中的作用引起了广泛关注。本研究应用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein，EGFP)作为报告基因，将APP695突变基因与其融合，构建突变型APP695EGFP融合基因载体，为进一步研究APP695突变在AD发病中的作用，以及筛选对AD有治疗作用的药物奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　携带野生型人类APP695的pCB6质粒，由美国加利福尼亚大学细胞分子医学院许华熙博士惠赠。携带EGFP的pIRES2质粒载体，由潍坊医学院免疫学教研室保存，DH5α感受态细胞为潍坊医学院免疫学实验室冻存。NheⅠ、HindⅢ、SmaⅠ、XbaⅠ等限制性内切酶，T4DNA连接酶与TaqDNA聚合酶，引物等均购自上海生工生物工程技术服务公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 pIRES2EGFPAPP695融合基因重组质粒的构建

　　将携带EGFP的pIRES2质粒载体用NheⅠ、HindⅢ酶切后，采用PCR扩增突变型APP基因，用Premier 5软件设计PCR引物，以 pCB6APP695野生型质粒载体DNA作为模板，PCR扩增突变APP基因。引物序列为：TA1 APPU ：5′attgctagcatgctgcccggtttggcactg3′，TA2 APPMU:5′tctgaagtgaatctggatgcagaat3′，TA3 APPMD：5′attctgcatccagattcacttcaga3′，TA4 APPD:5′gttaagcttctagttctgcatctgctcaaag3′。模式：引物TA2、3为一对反向互补的cDNA序列，但在其中引入两个LN，ML的突变，TA1、4包括了整个APP序列，并且含有NheⅠ、HindⅢ酶切位点(图1)。
　　
　　先将两个小片段进行PCR扩增得到回收片段，片段大小分别为1 785 bp、303 bp，将获得的两个小片段做PCR连接得到APP695突变全片段，进行PCR条件：94℃ 3 min，循环程序：94℃变性 45 s，52℃复性45 s，72℃延伸2 min 30 s。PCR结束后，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察结果并照相。

　　1.2.2 PCR产物APP695突变基因全长连至pIRES2EGFP载体

　　流程图见图2。经检测胶证实2 088 bp的PCR目的基因产物APP695，用低熔点琼脂糖电泳回收纯化后连接到pIRES2EGFP载体，进行质粒转化。

　　1.2.3 质粒DNA抽提

　　根据碧云天质粒抽提试剂盒操作。

　　1.2.4 质粒的酶切检测

　　提取的质粒DNA，分别用NheⅠ、HindⅢ行双酶切后，琼脂糖凝胶电泳验证。

　　1.2.5 测序反应及测序分析

　　委托上海生工生物工程技术服务公司进行测序分析。

　　2 结 果

　　2.1 目的片段的扩增

　　以pCB6APP695野生型质粒为模板，扩增出约1 780 bp左右的基因长片段和约300 bp左右小片段，将大小片段连接后得到约2 088 bp的基因片段，与人的APP695突变型基因大小一致（图3）。

　　2.2 pIRES2EGFPAPP695突变型质粒构建成功后酶切结果

　　将构建好的质粒载体，分别用NheⅠ、HindⅢ行双酶切，得到基因片段(约2 088 bp)和载体（5.3 kb）（图4）。

　　2.3 测序分析结果

　　阳性克隆经测序，所获基因序列与已发表的人APP695突变型基因序列相比基本一致（图5）。

　　3 讨 论

　　APP基因是AD基因分型中的AD1（家族性、常染色体显性）类型基因〔1〕，此基因定位于人染色体21q21.2，由19个外显子组成，按其转录产物的剪接方式不同可以生成若干种APP 的亚型，其中最主要的三种为APP695、APP751、APP770〔2〕。APP695蛋白为I型膜整合蛋白，主要在脑组织神经元中表达〔3〕，其比APP751、APP770缺少一段Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域，生理功能至今不明〔3～5〕。

　　β淀粉样蛋白（β amyloid protein，Aβ）是构成AD主要病理学特征之一，是老年斑（senile plaque，SP）的主要成分，是SP形成的始动因子，结构为β片层，又称为Aβ、βA、βA4〔1〕，来源于APP蛋白。脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)中Aβ42作为生物学标志物，用于AD的早期诊断和评估疾病状态〔4〕。APP基因产生突变后，导致Aβ聚集，从而使SP形成、突触减少、神经功能失调、神经元死亡，促进AD病情进展〔6〕。
　　
　　研究证明，APP代谢途径有两种：一种是被α分泌酶切断后产生可溶性APP(αAPPs)，被释放到细胞外，能减少Aβ的生成〔7，8〕；另一种是被β、γ分泌酶切断后生成Aβ，分泌到细胞外〔9〕，聚集纤维化后，形成淀粉样物质，沉积在脑内，从而导致AD的发生。有研究者试图从这两个途径找到根治AD的药物，以α、β、γ分泌酶作为治疗AD的可能靶点，目前试验支持α分泌酶治疗AD的有效性，但具体机制尚不明确〔10〕，而β、γ分泌酶抑制剂的研究过程中，γ分泌酶抑制剂为非选择性抑制剂，会产生Notch抑制的副作用，因此正在研制特异性的γ分泌酶调节剂和功能单一的β分泌酶抑制剂〔4，11〕。
　　
　　目前已知APP突变型基因比野生型基因更能够增加Aβ的生成。瑞典家系的突变（Swedish突变）是APP的670/671位点密码子双重突变，即两个碱基对发生改变（Lys→Asn，Met→Leu），使赖氨酸被天冬氨酸置换，蛋氨酸被亮氨酸替代，从而导致APP的代谢过程发生改变，造成Aβ过度沉积〔12，13〕。pIRES2EGFP载体含有pCMV启动子、EGFP的基因编码区以及两者之间的多克隆位点，既能在真核生物中表达，也能在原核生物中表达，同时EGFP比GFP产生的荧光强4～35倍〔14，15〕，而且能对目的基因表达情况示踪，所以本研究将APP695突变型基因连接到这个载体上，能更方便对APP695突变基因进行研究。 本实验经过酶切、PCR、测序鉴定，构建融合基因载体（pIRES2EGFP/APP695）成功，含有APP695突变基因的全长序列，无移码及突变。本研究将为以后深入研究AD分子机制和药物筛选奠定试验和物质基础。

参考文献

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