硫化氢在脂多糖所致老年大鼠急性肺损伤中的作用

　　　　 作者：周晓红 黄新莉 曹华 张雪静 凌亦凌

【摘要】 目的 探讨硫化氢（h3S）在脂多糖（LPS）所致老年大鼠急性肺损伤（ALI）中的作用机制。方法 64只SD老年大鼠随机分为对照组、LPS组、NaHS+LPS组、炔丙基甘氨酸（PPG）+LPS组，每组16只。LPS组、NaHS+LPS组、PPG+LPS组经气管内滴注LPS 200 μg/只，制备大鼠ALI模型；对照组经气管内滴注无菌生理盐水200 μl/只。NaHS+LPS组制模前10 min腹腔注射NaHS 28 μmol/kg，PPG+LPS组制模前10 min腹腔注射PPG 45 mg/kg。给药后4 h或8 h处死动物，测定肺系数；光镜观察肺组织形态学改变；化学法检测血浆h3S、NO和CO含量、肺组织丙二醛（MDA）含量、胱硫醚γ裂解酶（CSE）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和血红素加氧酶1（HO1）活性；采用免疫组织化学法检测肺组织iNOS、HO1蛋白表达及吸光度值。结果 气管内滴注LPS可引起肺组织明显的形态学改变；肺系数和肺组织MDA含量增加；血浆h3S含量和肺组织CSE活性下降；肺组织iNOS活性和iNOS蛋白表达增强，血浆NO含量增加；肺组织HO活性和HO1蛋白表达增强，血浆CO含量增加。预先给予NaHS可显著减轻LPS所致肺组织损伤，肺系数和肺组织MDA含量下降；血浆h3S含量和肺组织CSE活性升高；肺组织iNOS活性和iNOS蛋白表达减弱，血浆NO含量减少；肺组织HO活性和HO1蛋白表达增强，血浆CO含量增加（均P＜0.05）。而预先给予PPG可加重LPS所致肺损伤，使血浆NO含量、肺组织iNOS活性和iNOS蛋白表达进一步增加（均P＜0.05），但对血浆CO含量、HO活性和HO1蛋白表达无明显影响。结论 h3S/CSE体系的下调在LPS所致老年大鼠ALI的发病学中有一定作用，而外源性给予一定量的NaHS对肺组织具有保护作用，其可能与抗氧化效应和下调NO/iNOS体系、上调CO/HO1体系有一定关系。

【关键词】 硫化氢；老年大鼠；急性肺损伤；一氧化氮；一氧化碳；一氧化氮合酶；血红素加氧酶

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）主要病变特点是急性弥漫性肺泡和肺血管损伤，最终可发展至急性呼吸窘迫综合征，其发病机制尚未完全阐明。内源性气体信号分子NO和CO在ALI中的作用已得到证实〔1～3〕，研究表明h3S可能是继NO和CO之后的第3种气体信号分子〔4〕，参与神经和血管功能调节等多种生理和病理过程〔5～7〕。但h3S是否参与ALI的发病尚不清楚。研究发现，h3S和NO共同参与了LPS所致的肺动脉反应性异常〔8〕，推测h3S和NO、CO之间可能也存在某种联系。本研究着重观察ALI时h3S及其生成关键酶胱硫醚γ裂解酶（cystathionineγlyase，CSE）的变化；并应用h3S供体NaHS和CSE抑制剂炔丙基甘氨酸（propargylglycine，PPG）观察h3S对ALI时肺组织损伤指标和NO/诱导型NO合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、CO/血红素加氧酶1（hemeoxygenase1，HO1）体系变化的影响，探讨h3S在LPS所致ALI中的作用及可能的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物

　　清洁级健康雄性SD大鼠64只，20月龄，体重350～400 g（购于河北医科大学实验动物中心），自由摄食、饮水，室温18℃～24℃，相对湿度40%～70%，每日12 h光照维持，昼夜循环。

　　1.2 方法

　　1.2.1 试剂

　　大肠杆菌脂多糖（LPS E.coli O111:B4）、NaHS、炔丙基甘氨酸(PPG)、L半胱氨酸、5′磷酸吡哆醛、N，N二甲基对苯二胺硫酸盐、血红蛋白、血红素、NADP、6磷酸葡萄糖和6磷酸葡萄糖脱氢酶均购自Sigma 公司，抗iNOS多克隆抗体、抗HO1多克隆抗体购自博士德公司，SP免疫组化检测试剂盒购自北京中杉生物技术公司，NO与CO、iNOS与HO、丙二醛（MDA）、考马斯亮蓝检测试剂盒购自南京建成生物公司。

　　1.2.2 模型制备

　　SD大鼠适应性喂养1 w后，按窝别随机分为对照组、LPS组、NaHS+LPS组、PPG+LPS组，每组16只。对照组气管内滴注等量生理盐水200 μl/只；LPS组气管内滴注LPS（200 μg/只，溶于200 μl生理盐水中）；NaHS+LPS组LPS滴注前10 min腹腔注射NaHS（28 μmol/kg，溶于0.5 ml生理盐水）；PPG+LPS组滴注LPS前10 min腹腔注射PPG（45 mg/kg，溶于0.5 ml生理盐水）。

　　1.2.3 检测指标

　　滴注药物后4 h或8 h颈总动脉放血处死动物。取血浆采用去蛋白的分光光度法〔5〕根据h3S标准曲线计算上清液中h3S的含量；采用硝酸还原酶法间接测定血浆NO含量；参照Chalmber等〔9〕的双波长分光光度法，以血浆中HbCO的百分比含量(%)代表CO含量；取全肺自气管分叉以上5、6软骨环间剪断气管，用滤纸吸干肺表面血污后称质量测定肺系数［肺系数=全肺湿质量(g)/体质量(kg)］。留取左侧肺叶下部以10%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片，经HE染色采用分光光度法测定iNOS及HO1活性（HO活性检测采用HO降解血红素生成胆绿素和CO的原理，以1 mg HO蛋白1 h催化血红素降解生成胆红素的pmol数，以此表示HO活性）。取左侧肺叶中上部制备肺组织匀浆，采用硫代巴比妥酸法测定肺组织中MDA含量；参照文献〔6〕方法测定肺组织CSE活性（组织中CSE活性以每毫克组织在每分钟生成h3S的nmol表示）。

　　1.2.4 肺组织形态学观察

　　光镜下观察肺组织形态结构变化。每组选取6张玻片，每张玻片连续观察10个视野（100倍），计算损伤肺泡（肺泡内含有红细胞或/和中性粒细胞2个以上）数占计数肺泡总数百分比，即肺泡损伤数比值作为肺损伤的组织学定量评价指标（IQA）。

　　1.2.5 肺组织中iNOS蛋白、HO1蛋白的免疫组织化学检测及计算机图像分析

　　采用SABC法检测大鼠肺组织iNOS蛋白、HO1蛋白表达。切片常规脱蜡、脱水，一抗滴度为1∶100，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，细胞浆染成棕黄色的即为阳性细胞。用全自动图像分析系统检测肺组织iNOS的平均光密度值，作为iNOS的相对表达量［各组取5张切片，每张切片随机取3～5个视野（400倍）做图像分析，计算5张切片的平均光密度，作为该组阳性细胞的平均光密度］。

　　1.3 统计学处理

　　数据均以x±s表示，进行正态性检验，多样本均数比较进行方差齐性分析，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用q检验。应用SPSS10.0统计软件进行分析。

　　2 结 果

　　2.1 肺组织形态学改变

　　光镜下对照组肺组织结构清晰，肺泡壁薄，肺泡内未见水肿液，肺泡腔内可见少量淋巴细胞及单核巨噬细胞。滴注LPS后肺泡间隔增厚、断裂，PMN浸润，肺泡内可见浆液、红细胞，且大鼠的肺损伤随时间的延长而加重；与对照组相比IQA明显增高（均P＜0.05）。NaHS+LPS组肺组织病变较相应时间点的LPS组明显减轻，大部分肺组织接近正常，局部肺组织少量炎细胞浸润，肺泡隔略有增宽，IQA亦较相应时间点LPS组明显下降（均P＜0.05）。PPG+LPS组肺组织损伤较LPS组加重，IQA亦升高，尤以8 h组明显（P＜0.05)（图1，表1）。

　　2.2 肺系数和肺组织中MDA含量的变化

　　见表1。肺系数和MDA含量LPS组明显高于对照组（P＜0.05）和NaHS +LPS组（P＜0.05），低于PPG+LPS组（P＜0.05）。表1 各组大鼠肺系数、肺组织MDA含量及IQA的变化(略)

　　2.3 血浆h3S含量和肺组织CSE活性的变化

　　见表2。血浆h3S含量和肺组织CSE活性LPS组低于对照组（P＜0.05）和NaHS +LPS组（P＜0.05），高于PPG+LPS组（P＜0.05）。表2 各组大鼠血浆h3S含量和肺组织CSE活性的变化(略)

　　2.4 血浆NO含量及肺组织iNOS活性的变化

　　见表3。LPS滴注4 h、8 h后血浆NO含量和肺组织中iNOS活性明显高于对照组（P＜0.05）和NaHS +LPS组（P＜0.05），低于PPG+LPS组（P＜0.05）。

　　2.5 血浆CO含量及肺组织HO1活性的变化

　　见表4。LPS 组4 h血浆CO含量和肺组织HO1活性无明显变化，而8 h二者明显增高（P＜0.05）；NaHS+LPS组血浆CO含量和HO1活性显著高于LPS组及对照组（均P＜0.05）；PPG+LPS组与LPS组比较血浆CO含量和HO1活性无明显差异。表3 各组大鼠血浆NO含量及肺组织iNOS活性的变化(略)表4 各组大鼠血浆CO含量及肺组织HO1活性的变化(略)

　　2.6 肺组织iNOS表达的变化

　　见表5。对照组肺组织中偶见iNOS阳性细胞；LPS 4、8 h肺组织可见iNOS棕黄色阳性染色信号较对照组明显增强，主要表达部位在肺泡间质的单核巨噬细胞、中性粒细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、支气管上皮细胞，平均光密度值显著高于对照组（均P＜0.05）；NaHS+LPS组iNOS蛋白表达量较相应时间点的LPS组减弱（P＜0.05）；PPG+LPS组iNOS蛋白表达量与LPS组比较则明显升高（P＜0.05）。

　　2.7 肺组织HO1的表达

　　见表5。对照组肺组织中偶见HO1阳性细胞；LPS 4、8 h肺组织可见明显的HO1棕黄色阳性染色信号，主要分布于气道上皮、肺泡壁、血管壁和炎细胞胞质中；NaHS+LPS组HO1蛋白表达量较LPS组增加（P＜0.05）；PPG+LPS组HO1蛋白表达量与LPS组比较无明显区别。表5 各组大鼠肺组织iNOS蛋白及HO1蛋白相对表达量的变化(x±s，n=10)

　　3 讨 论
　　
　　目前h3S生理和病理作用的研究尚处于起步阶段，但有研究表明，h3S具有多方面的生物学作用，如参与低氧性肺动脉高压和感染性休克〔5，6〕以及减轻兴奋性氨基酸对神经元的毒性作用等〔7〕。本研究显示，在LPS引起肺组织损伤的同时，血浆h3S含量和肺组织CSE活性下降；预先给予NaHS可使h3S含量和CSE活性升高，肺损伤也明显减轻；预先给予PPG抑制CSE活性和h3S生成，则使LPS所致的肺损伤有所加重。提示h3S/CSE体系的下调在LPS所致ALI的发病学中有一定作用，而给予一定量的外源性h3S对肺组织具有保护作用。关于其保护作用的机制尚不十分清楚。本研究证实，外源性h3S可一定程度减少ALI时肺内MDA的生成，抑制内源性h3S可增加MDA产量，提示h3S具有一定的抗氧化作用，这与其他研究报道h3S具有清除活性氧的作用是一致的〔10〕。

　　NO是最早发现的气体信号分子，可参与生理状态下多种肺疾病的发生〔11〕。NOS是合成NO的关键酶，iNOS诱导产生的过量的NO具有细胞毒性作用〔12〕，其作用可由ONOO介导〔13〕。CO由于近年来被证实具有抗炎、抗氧化等作用而被引起广泛关注。机体内源性CO主要由HO1催化血红素降解产生，可作为保护性蛋白被细菌内毒素、炎性细胞因子、NO等多种因素诱导表达〔14〕。但在NO、CO和h3S均参与LPS所致肺损伤的情况下，h3S与前两者的作用是否存在联系还需进一步研究。本研究结果显示，LPS使h3S减少的同时上调NO/iNOS体系，上调CO/HO1体系可能是机体对抗损伤性刺激的一种保护性反应。给予PPG抑制内源性h3S的产生，可进一步上调NO/iNOS，对LPS诱导的HO1表达并无明显影响。给予h3S供体NaHS可下调NO/iNOS、上调CO/HO1，推测ALI时三种气体信号分子间可能存在相互调节的关系，具体机制有待进一步研究。

参考文献

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