作者：王林，辛晓燕，王哲，谢学军
【关键词】 妊娠并发症
【Abstract】AIM: To study the relationship between the apoptosis and expression of heat shock protein 70 (HSP70) and bax in placentas of serious pregnancy induced hypertension (SPIH). METHODS: Placental samples were obtained from 25 uncomplicated thirdtrimester pregnancies and from 25 cases of SPIH. Light microscopy and electron microscopy were used to identify and quantify apoptosis. HSP70 and bax were detected by immunohistochemical staining. The expression of HSP70 protein was assessed by Western blot. RESULTS: Apoptosis has been demonstrated within human thirdtrimester placental tissues. Medians and interquartile ranges of SPIH group were 0.36%（0.20%-0.46%）and those of the normal control were 0.15% （0.09%-0.21%）. The incidence of apoptosis was higher in placentas of SPIH (P&<0.05). The positive rates of HSP70 were 100% in SPIH group and 93% in control， but the intensity of staining was significantly different between these two groups (P&<0.01). In comparison to those in the normal control， the expression of HSP70 increased in placentas of SPIH group. The positive rates of bax were 84% in SPIH group and 43% in control， respectively (P&<0.01). CONCLUSION: Increased placental apoptosis in SPIH and the upregulation of expression of bax are simultaneous. The expression of HSP70 does not increase resistance to placental apoptosis in SPIH and it may play a role in the pathophysiologic mechanism of PIH.
【Keywords】pregnancy complications，cardiovascular; placenta; apoptosis; heat shock proteins 70 ; bax
【摘要】 目的: 观察重度妊高征（SPIH）胎盘组织细胞凋亡现象，研究热休克蛋白70（HSP70）及bax在胎盘组织细胞凋亡中的作用.方法： 随机选取SPIH患者及正常晚孕胎盘组织各25例，用光镜、电镜观察细胞凋亡现象.免疫组化观察HSP70， bax在正常妊娠及SPIH胎盘组织中的表达，Western blot检测HSP70在二者之间的蛋白表达差异. 结果： 在晚孕胎盘组织中可见到凋亡细胞，SPIH组细胞凋亡发生率的中位数及四分位数范围为0.36 %（0.20%-0.46%），正常对照组为0.15%（0.09%-0.21%）.二者之间有显著性差异（P&<0.05）. HSP70在SPIH组与对照组的阳性表达率分别为100%和93%，无显著性差异.但在表达强度上有明显的差别（P&<0.01）.Western blot的结果显示HSP70在SPIH胎盘组织中的表达增强.bax在SPIH组的阳性率为84%，对照组为43%，有显著性差异(P&<0.01).结论: SPIH胎盘组织细胞凋亡增多与bax的表达上调有一致性；HSP70不能抑制胎盘细胞凋亡，可能对胎盘的组织细胞有保护调节的作用.
【关键词】 妊娠并发症，心血管；胎盘；脱噬作用；热休克蛋白质类70；bax
0引言
重度妊娠高血压综合征(serious pregnancy induced hypertension， SPIH)是导致围产期母婴发病率、死亡率上升的重要原因， 其病理机制不清［1］.妊高征的临床特点及基础研究提示，其发病与胎盘有关［2］.Stephen等［3，4］发现胎盘组织中存在着细胞凋亡现象，并认为与一些孕期疾病的发生发展相关.热休克蛋白70(HSP70)是非特异性的保护蛋白，以往认为有抑制细胞凋亡的作用［5］.但新近的研究［6］发现，在不同的凋亡模型中其作用不一样.而bax的表达可促进细胞凋亡［7］.我们拟观测重度妊高征患者胎盘组织中的细胞凋亡现象，检测HSP70及bax在SPIH胎盘组织及正常胎盘中的表达情况，探讨二者与妊高征胎盘组织细胞凋亡的关系.
1对象和方法
1. 1对象随机选取自200109/200203在西京医院住院分娩的重度妊娠高血压综合征患者25例，孕妇年龄27.3±3.1岁，孕周36.8±3.7 wk；另选择同时期入院分娩的正常妊娠妇女25例，年龄26.9±3.9岁，孕周38.0±3.9 wk.两组均行均衡性检验，显著性无差异（P&<005）.重度妊娠高血压综合征的诊断标准以乐杰主编的第五版全国统编教材为准.所有病例均为单胎初次妊娠.对照组无妊娠合并症、并发症；两组病例均无胎膜破裂时间延长，无吸烟及孕期大量药物服用史，亦无孕期感染及孕晚期发热史.胎盘样本取自自然分娩或选择性剖宫产.鼠抗HSP70(W27)及鼠抗bax(B9)购自SANTA CRUZ公司，DAKO EnVision试剂盒购自DAKO公司.
1. 2方法
1. 2. 1标本收集胎盘娩出后，立即从母体面随机选取2块大小约为3 cm×2 cm×1 cm的组织（避开钙化灶）.生理盐水冲洗后，每块标本切取约1 cm×1 cm×1 cm的组织，40 g・L1PBS甲醛溶液固定.用于电镜检查的组织放入25 g・L1的戊二醛液中固定.其余部分立即置入-70℃冻存.前者常规石蜡包埋，4 μm连续切片备染.
1. 2. 2光镜、电镜检查所有的标本均行光镜检查.切片用苏木精伊红染色，分别由两人观察，双盲操作.每张切片观察10个高倍视野，蜕膜组织细胞不计数在内.使用透射电镜各检查4例SPIH及正常胎盘组织.所检标本与相对应的光镜检查切片取自同一胎盘组织块.
1. 2. 3免疫组化切片脱蜡后行抗原修复，分别滴加HSP70及bax抗体4℃过夜；DAKO EnVision加入后温育1 h，DAB显色.苏木精复染，脱水封片.光镜观察.阳性结果为细胞内有棕黄色颗粒出现，依显色程度分3级：阴性无显色，浅棕黄色为阳性，棕褐色为强阳性.
1. 2. 4Western Blot随机从SPIH组及对照组中各取标本20例.从-70℃冻存标本中切取组织100 mg，加入裂解液300 μL （TrisHCl 10 mmol・L1， MgCl2 1 mmol・L1， EGTA 1 mmol・L1， PMSF 0.1 mmol・L1， βmercaptoethanol 5 mmol・L1， CHAPS 5g・L1， Glycerol 100 mL・L1），置入匀浆器中捣碎，冰浴30 min后，低温高速离心12 000 g，30 min，取上清液.紫外线分光光度计测样品浓度，等量蛋白上样进行SDSPAGE电泳.100 V恒压电泳约3 h后，转印于硝酸纤维素膜.用小牛血清白蛋白封闭，加入1100稀释的HSP70抗体，4℃过夜后，37℃复温1 h.110稀释的鼠抗DAKO EnVision放大信号，DAB显色后照相.图像分析，测表达蛋白的灰度值.
统计学处理： 应用SPLM统计学软件包.两组细胞凋亡的显著性检验用Mannwhitney U检验.统计免疫组化阳性例数，计算阳性率，率间比较用χ2检验，P&<0.05为统计学有意义.Western Blot结果行t′检验.
2结果
2. 1凋亡细胞的确认及检测SPIH组及正常胎盘中均见到凋亡细胞核(Fig1，2)，多位于合体滋养细胞中.电镜检查见到凋亡细胞核的染色体在完整的核膜边缘聚集浓缩，在SPIH胎盘组织中尤为明显，凋亡的合体滋养细胞核常成簇.计算凋亡细胞核占所检细胞核的比例，得到胎盘组织中凋亡细胞的总发生率.SPIH组胎盘细胞凋亡发生率的中位数及四分位数范围为0.36 %（0.20%-0.46%），正常对照组为0.15%（0.09%-0.21%）.前者的凋亡细胞较后者明显增多，有显著性差异（P&<0.01）.
图1重度妊高征胎盘滋养细胞层中的凋亡细胞核 （略）
Fig 1Light microscopy of placental tissue of SPIH，Apoptotic nuclei within trophoblastHE ×400（略）
图2孕晚期胎盘组织中凋亡的合体滋养细胞核（略）
Fig 2Thirdtrimester placenta， transmission electron micrograph showing apoptotic nuclei within syncytiotrophoblast×5000（略）
2. 2HSP70的表达免疫组化的阳性结果显示HSP70在合体滋养层细胞以及蜕膜细胞有表达，偶可见于霍夫包尔细胞.主要在细胞质中呈阳性着色(Fig3).HSP70在SPIH组的阳性率为100%，在对照组的阳性率为93%，两组之间无显著性差异（P&>0.05）.在表达强度上，PIH组的强阳性率为68%，而对照组为20%，二者之间有显著性差异(P&<0.01).Western Blot的结果显示，HSP70在SPIH组的表达较正常妊娠组增高(Fig 4)，两组的灰度值（0~255）分别为 120±4和147±6，有显著性差异(P&<0.01).
图3HSP70在正常胎盘组织上的表达（略）
Fig 3Immunohistochemical staining of HSP70 in placental tissue of normal control×400（略）
1:Ｎormal control; 2: SPIH; 3: Marker.
图4Western blot 的结果（略）
Fig 4Western blot analysis of HSP70 expression in placental tissue（略）
2. 3bax的表达免疫组化结果显示bax主要在胎盘合体滋养细胞及细胞滋养细胞上有表达，阳性定位于细胞质和胞膜上(Fig 5).在SPIH组的阳性率为84%（21/25），对照组为44%（11/25）.二者之间有显著性差异(P&<001).
图5bax在SPIH胎盘组织上的表达（略）
Fig 5Immunohistochemical staining of bax in placental tissue of SPIH×200（略）
已往的研究表明，细胞凋亡与胎盘的发育老化的过程及病理妊娠的发生发展有关.本实验观察到：重度妊高征胎盘组织中细胞凋亡较正常晚孕胎盘组织增高.后者的细胞凋亡是一种生理现象，而SPIH胎盘组织中细胞凋亡的增多则是病理性的.妊高征的基本病变为全身小动脉痉挛，使各器官组织因缺血缺氧而造成损害.凋亡细胞增多可能是继发于局部血供不良、胎盘床缺氧等变化，是清除受损组织的重要现象.Nelson等认为胎盘滋养层细胞凋亡是协助胎盘物质交换的生理过程之一［8］.妊高征胎盘凋亡细胞的增多为营养物及氧顺利地运送到胎儿，起到了一定的代偿作用.需要说明，细胞凋亡没有分子标志物，对凋亡细胞的确认依赖于形态学特征［9］.目前，在确认和计数细胞凋亡上，TUNEL技术有广泛的应用［10］.但在研究胎盘的细胞凋亡时，发现有假阳性等问题［9，11，12］.因此，在电镜的配合下使用光镜计数仍是可靠易行的研究方法.
HSP70在胎盘中的表达及功能的研究不多见.Shah M等报道，HSP70在正常胎盘的多种细胞中有表达［13］.本研究支持这一观点，且表明HSP70在SPIH的胎盘中表达上调.这对胎盘滋养细胞有一定的保护作用，提高了胎盘组织对上述病理改变的耐受性.HSP70与细胞凋亡的关系，目前意见不一.以往通过对肿瘤细胞凋亡的研究，有学者认为HSP70是除bcl2之外重要的抗凋亡蛋白.但近期有研究提示，HSP70没有抗细胞凋亡的作用［6］.
从本实验结果分析，HSP70在SPIH组表达上调与以往认为的其抑制凋亡的作用不一致.类似的结果在其他组织的细胞凋亡研究中也有报道［14］.bax是一种细胞凋亡的促进因子，与bcl2有21%的同源性，可在细胞内形成bax/bcl2异二聚体和bax/bax同二聚体.其高表达可引起细胞线粒体通透性增加，加速细胞凋亡［7］.本实验中bax在SPIH胎盘组织中表达上调与细胞凋亡增加有一致性，可认为是介导胎盘凋亡的途径之一.
对凋亡的深入研究发现，其机制复杂.诱发细胞凋亡除p53，bax；Fas，caspase等多种途径外，也可以不通过受体配体系统直接引起细胞凋亡［15，16］.本研究中HSP70不能抑制胎盘细胞凋亡的增加，亦不影响促凋亡因子bax的过表达.但作为应激蛋白（Stress protein， SP），妊高征的胎盘缺氧、绒毛纤维素样坏死增多等变化可引起HSP70的大量表达.HSP70在细胞凋亡和坏死等病变中的作用可能不同，这尚需在今后的研究中进一步探讨.
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