作者：李毅，戚好文，刘颖格，陈秉耀
【关键词】 氟伐他汀
【Abstract】AIM： To study the effects of fluvastatin， a new synthetic inhibitor of 3-hydrox-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase， on the proliferation of airway smooth muscle cell (ASMC) from rats. METHODS： MTT and cell growth counts were used to analyze the effects of fluvastatin on the proliferation of ASMC. RESULTS： Fluvastatin inhibited the proliferation of ASMC stimulated by fetal calf serum or histamine. The inhibitory rate of the proliferation of ASMC was above 20% or 100% when the concentrations of fluvastatin were 10-5 mol・ L-1 or 10-4 mol・L-1 and there was a concentration-dependent decrease in the proliferation of rat ASMC. CONCLUSION： Fluvastatin can inhibit ASMC proliferation either stimulated by fetal calf serum or histamine.
【Keywords】 fluvastatin; airway;muscle，smooth; hyperplasia; asthma
【摘要】 目的: 观察氟伐他汀（Fluvastatin）对离体培养的大鼠气道平滑肌（Airway Smooth Muscle Cell， ASMC）增生的影响.方法: MTT法及细胞计数检测体外培养的ASMC的增生.结果: 氟伐他汀对于由血清和组织胺刺激引起的ASMC增生均具有抑制作用(P&<0.01)，1×105 mol・L-1浓度的氟伐他汀对ASMC的增生的抑制率达20%以上，而1×10-4 mol・L-1浓度的氟伐他汀则可完全抑制ASMC的增生.结论: 氟伐他汀可抑制ASMC的增生，且这种作用与其浓度呈一定相关性.
【关键词】 氟伐他汀;气道；肌，平滑; 增生；哮喘
0引言
哮喘是一种慢性气道反应性炎症，其主要临床特征为气道高反应性和可逆性的气道阻塞.大量尸体解剖资料显示，哮喘患者气道内不仅有炎症存在，还有气道平滑肌细胞（Airway Smooth Muscle Cell， ASMC）的显著增生［1-4］.ASMC增生是产生气道重建（Airway remodeling）的重要原因，并与气道高反应性的发生密切相关，气道重建已成为哮喘发病机制中具有特殊意义的因素，如何抑制哮喘患者气道重建是国内外医学界所广泛关注的课题［３，４］.国内外学者已采用多种方法对气道重建的发生机制及如何防治进行了广泛研究，并取得初步进展.近年来有研究发现氟伐他汀（Fluvastatin）不但有降低人体内胆固醇的作用，还发现它对多种细胞的增生具有抑制作用.本研究观察氟伐他汀对离体培养的大鼠ASMC增殖的影响，为氟伐他汀用于防治哮喘患者气道重建提供实验依据.
1材料和方法
11材料Ⅳ型胶原酶、兔抗鼠βactin mAb、组织胺、MTT：Sigma公司；DMEM：Gibco公司；胎牛血清（FCS）：杭州四季青生物制品工程公司；氟伐他汀：瑞士诺华制药有限公司.
12方法
1.2.1大鼠ASMC分离与培养健康、雄性SD大鼠（第四军医大学实验动物中心提供）1只，体质量260 g，脊椎脱臼法处死，无菌剥离气管，细心剥离气管内、外膜，剪碎剩余组织块，约1 mm×1 mm×1 mm大小，2 g・L-1Ⅳ型胶原酶37℃消化2次，每次30 min，中间吹打组织块1次，用含100 mL・L-1胎牛血清的DMEM冲洗，100目不锈钢网过滤，离心后制成细胞悬液，接种于培养瓶内.
1.2.2大鼠ASMC纯化经原代培养后，细胞呈多克隆生长，选择细胞形态呈梭形的克隆在倒置显微镜下机械分离.分离所得细胞继续培养一代，2.5 g・L-1胰酶短暂消化，13传代，静置细胞30 min，去除未贴壁细胞，利用平滑肌细胞容易贴壁的特性进一步纯化所得细胞.
1.2.3大鼠ASMC鉴定ASMC离体培养时呈梭形，有较长的突起，细胞核位于细胞中央，排列成旋涡状、放射状或栅栏状是其生长特点.培养细胞经SABC免疫组织化学鉴定，98%细胞βactin阳性.4~12代于对数生长期的细胞用于实验.
1.2.4对ASMC生长的影响 以2×104个/孔将细胞接种于96孔培养板内，37℃下孵育36 h使细胞贴壁，弃上清液，无血清DMEM清洗2遍，进行以下试验 ① 血清培养试验: 每孔先加入100 mL・L-1FCS约200 μL，再加入氟伐他汀使其终浓度分别为1×10-5mol・L-1，1×10-4 mol・L-1；② 组织胺培养试验：每孔加入10 mL・L-1 FCS约200 μL，然后加入组织胺使其终浓度为1×10-2 mol・L-1，最后加入氟伐他汀，终浓度分别为1×10-5 mol・L-1，1×10-4 mol・L-1；③ 经上述处理后，置于37℃，50 mL・L-1CO2条件下分别培养1，2，3，4 d后取出.每孔加MTT液（5 g・L-1）20 μL，再于37℃下孵育4~6 h后中止培养，弃上清，每孔加DMSO 150 μL，振荡10 min，使结晶物溶解，在酶联免疫检测仪测各孔A490 nm值.
1.2.5细胞分裂指数的测定将平滑肌细胞以8×104个/瓶接种于置有小盖玻片的25 mL培养瓶中，24 h孵育贴壁后加入氟伐他汀，使其终浓度分别为1×10-5 mol・L-1和1×10-4 mol・L-1，于37℃，50 mL・L-1CO2条件下培养48 h后将盖玻片取出，95 g・L-1乙醇固定30 min，HE染色封片.选取密度适中的区域计数1000个细胞，观察分裂细胞在其中所占的比例.
1.2.6细胞计数将平滑肌细胞以8×104个/瓶接种于25 mL培养瓶中，24 h孵育贴壁后加入氟伐他汀，使其终浓度为1×10-4 mol・L-1，并分别于第2，4，6，8日胰酶消化计数.
统计学处理:所有计量结果用x±s表示，组间比较采用oneway ANOVA检验.
2结果
2．1四唑盐比色试验（MTT）氟伐他汀对由血清和组织胺所激发的平滑肌生长都具有明显抑阻作用，利用MTT法检测氟伐他汀组吸收光值均明显低于对照组(Tab 1， 2)，细胞计数的结果显示氟伐他汀对处于增生状态的ASMC具有明显抑增生作用(Tab 3).且氟伐他汀的这种抑制增生作用与其浓度呈依赖性，1×10-5 mol・L-1浓度的氟伐他汀对ASMC的增生的抑制率在20%～30%以上，而1×10-4 mol・L-1浓度的氟伐他汀则可完全抑制ASMC的增生.
表1氟伐他汀对由FCS刺激ASMC增生的影响（略）
Tab 1Effect of fluvastatin on the proliferation of ASMC induced by FCS（略）
表2氟伐他汀对由组织胺刺激ASMC增生的影响（略）
Tab 2Effect of fluvastatin on the proliferation of ASMC induced by Histamine（略）
表3氟伐他汀对ASMC增殖的影响（略）
Tab 3Effect of fluvastatin on the proliferation of ASMC（略）
2．2细胞分裂指数的测定对照组中处于分裂相的平滑肌细胞所占比例为（10.4±1.88）%，在1×10-5 mol・L-1浓度组中此比例为（3.73±0.93）%，而在1×10-4 mol・L-1浓度组中仅偶见处于分裂相的细胞，说明细胞分裂几乎完全被抑制，此结果与MTT的结果具有一致性.
3讨论
近年研究发现，很多支气管哮喘（哮喘）患者均存在程度不同的气道壁结构改变，除炎性细胞浸润外，主要表现为平滑肌层增厚和基底膜增厚及其玻璃样变，并将该改变称为气道重建［５］.由此导致气流不可逆阻塞和持续的气道高反应性，可能是顽固性哮喘的病理基础，因此消除气道重建是治疗哮喘的另一途径.气道重建的过程不但存在ASMC的肥大，也存在ASMC的增生.在哮喘发病机制中有许多炎性介质和细胞因子都可以刺激ASMC的增生，如组胺、内皮素、白三稀、TXA2等 ［6-9］.通过对ASMC增生抑制因素的研究可减轻或消除气道重建的发生.
通过大鼠ASMC的培养及应用氟伐他汀对ASMC增生抑制的研究结果显示氟伐他汀具有显著的抑制ASMC增生的作用.同在FCS中培养，加入终浓度1×10-5 mol・L-1的氟伐他汀对ASMC的增生的抑制率大于20%-30%，而加入终浓度1×10-4 mol・L-1的氟伐他汀则可完全抑制ASMC的增生，这也说明氟伐他汀对ASMC增生的抑制作用具有一定的浓度相关性.采用近似的模拟哮喘患者体内的一种重要炎性介质―组织胺刺激细胞生长也显示了同样的结果，加氟伐他汀组的光吸收值显著低于正常对照组.
氟伐他汀是3羟基3甲基戊二酰辅酶A（HMGCoA）还原酶抑制剂的一种，是一种人工合成药物.HMGCoA还原酶是胆固醇合成途径中的重要限速酶，催化HMGCoA生成甲羟戊酸，在甲羟戊酸、胆固醇的合成中起关键作用.氟伐他汀的侧链部分与HMGCoA结构相似，可竞争抑制HMGCoA还原酶的作用，抑制HMGCoA转化为甲羟戊酸，而甲羟戊酸及其衍生物除作为结构性胆固醇前体外，更重要的是在调节细胞增殖和DNA合成中起直接作用.因此甲羟戊酸代谢途径受阻，致使细胞内的胆固醇合成减少，最终导致血胆固醇水平的降低［１０］.HMGCoA还原酶抑制剂除了目前临床上作为高胆固醇血症的治疗用药以外，近年的许多研究还发现它对多种细胞的生长、增殖具有抑制作用，
哮喘患者气道平滑肌的增生受到气道内局部介质的浓度的重要影响，炎症使气道上皮脱落，保护屏蔽受损，血管及细胞内的各种介质渗入气道壁，局部介质浓度增高，刺激ASMC的增生，这一点已为各种实验所证实；再者由于气道内上皮可产生多种抑增生因子，上皮的脱落液使这些因子的浓度降低而使ASMC失去抑增生作用，因此局部增生与抑增生物质的失衡是导致ASMC增生的重要原因.尽管若患者服用氟伐他汀后，血液及气道内的药物浓度尚难证实，但体外实验确已证实在较低的浓度下氟伐他汀确有抑制ASMC增生的作用，这说明也许氟伐他汀可作为一种经济适用、高效、副作用少的药物应用于哮喘患者气道重建的治疗，并为之提供一个新的思路.
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