【Abstract】 AIM： To observe rat hippocampal neuron morphological characteristics at different developmental and differential stages in lowdensity culture. METHODS: Neuron and astrocyte threedimensional coculture method was used. Acquire newborn rat astroglial monolayer and dissect embryonic 18 d rat hippocampus and obtain singlecell suspension through trypsin digestion. Plate the suspension to polyLlysin coated coverglass in（2-5）×103 ・ cm-2 density. Transfer the coverglass to astrocyte culture section， coculture neurons with astrocytes in serumfree medium and observe neuronal morphological characteristics at different stages. RESULTS: Rat hippocampal neuron in lowdensity culture model was successfully acquired， which had distinct morphological characteristics at different stages. CONCLUSION: Hippocampal neuron in vitro has distinct morphological characteristics at different developmental and differential stages.
【Keywords】 lowdensity; cells，cultured; neurons; morphology
【摘要】 目的： 建立大鼠海马神经元低密度体外培养方法，并观察其发育分化过程中的形态学指征变化情况. 方法： 采用神经元与星形胶质细胞立体共培养方法.首先以新生大鼠为实验材料培养纯化单层星形胶质细胞，随后以孕18 d胎鼠为实验材料，分离海马皮层，经胰酶消化制备单细胞悬液.以（2～5）×103 ・ cm-2密度接种于包被有多聚赖氨酸的盖玻片上，而后采用无血清培养液与星形胶质细胞立体共培养，并对不同培养时间的神经元进行形态学观察. 结果： 利用低密度体外培养方法成功培养出海马神经元，其在不同发育分化阶段具有不同的形态学特征. 结论： 低密度培养的海马神经元不同发育分化阶段具有不同的形态学特征，为今后的相关研究奠定了基础.
【关键词】 低密度；细胞，培养的；神经元；形态学
0引言
神经元体外培养模型是神经元发育分化、神经再生、神经疾病的发生机制等众多研究领域的重要模型.神经元是分化终末细胞，高度极性化，由于其生长对细胞密度有依赖性，常规培养方法很难使神经元在低密度的培养条件下存活.Goslin和Banker［１］ 建立的神经元低密度培养方法被国际上广泛采用.我们参照原有方法，成功培养出海马神经元， 并对其进行了形态学观察，为今后的相关研究奠定了基础.
1材料和方法
1.1材料 新生3 d（P3）和孕18 d (E18) SD大鼠由第四军医大学实验动物中心提供；MEM(Minimum Essential Medium)，N2、胎牛血清（FBS）、DHanks 平衡盐液均购自Gibco公司； 胰酶、多聚赖氨酸购自Sigma公司； 35 mm培养皿、25 cm2培养瓶购自NUNC公司； Heraeus CO2孵箱；Olympus倒置相差显微镜； 恒温摇床；解剖显微镜.
1.2方法
1.2.1星形胶质细胞的培养纯化采用McCarthy和de Vellis的方法［2］.P3 SD大鼠，低温麻醉后750 mL・L-1乙醇消毒，无菌操作下，断头放入预冷的DHanks 液中， 在解剖显微镜下取大脑皮层并除去脑膜.剪碎组织成1 mm×1 mm ×1 mm 大小，加入125 g・L-1 胰酶并放入37 ℃孵箱消化20 min，中间摇晃１次.用滴管吸出组织转移到装有冷的 MEM+100 mL・L-1 FBS(GLIAL MEDIUM，GM)的离心管内终止胰酶作用5 min. 吸出组织转移到另一支装有冷的GM的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清并吸到另一支离心管内.重复上述步骤2～3次.所得上清于800 r・min-1离心5 min，弃上清，管内加入新鲜GM并吹打成单细胞悬液.细胞计数，调整细胞密度，按1×104 ・cm-2种入25 cm2 培养瓶，放入孵箱培养.以后每隔2～3 d进行全量换液.第9日换液后放入孵箱24 h，取出拧紧培养瓶盖于37 ℃ 恒温摇床上280 r・min-1 18 h.吸去悬液， DHanks液洗2次后常规传代，以1×104 ・cm-2 种入35 mm培养皿.
1.2.2海马神经元的取材与培养将经洁净处理干烤灭菌后的2 cm×2 cm盖玻片放入35 mm培养皿内，并在四角各滴一滴无菌石蜡约0.1 mm厚. 用 100 μg・L-1 多聚赖氨酸于37 ℃包被玻片4 h，三蒸水洗3次晾干备用. E18 SD大鼠经腹腔注射10 g・L-1 戊巴比妥钠麻醉后，碘酒乙醇消毒，取胚胎海马皮层，制备单细胞悬液，方法同前. 调整细胞密度按（2～5）×103 ・ cm-2 种入放有盖玻片的35 mm培养皿内，放入孵箱.
1.2.3神经元与星形胶质细胞的立体共培养待星形胶质细胞生长达50 % 左右融合度时，换成MEM+N2培养液. 神经元接种后4 h 已贴壁.此时将盖玻片翻转转移到星形胶质细胞培养皿中，使神经元面向星形胶质细胞.放入孵箱，每3 d半量换液.选取不同时间点在相差显微镜下观察神经元形态特征并照相.
2结果
星形胶质细胞纯化后经胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色，纯度在95％以上(Fig 1).海马神经元体外发育分为明确的五个阶段（stage）: 刚接种后，细胞呈圆形，折光性强， 4～6 h后多数细胞长出数个细小突起，突起长度之间无明显区别（Stage1～2，Fig 2A）；12～24 h后，细胞突起之间有一个生长加快，生长锥较大，长度明显长于其他突起而形成轴突（Stage3，Fig 2B）；4 d左右时，生长较慢的突起形成分枝，成树突结构，同时轴突更长，分枝更多（Stage4，Fig 2C）；7 d左右时，突起分枝更多交错成网状，树突和轴突较难分辩，细胞已具有成熟神经元的形态学特点（Stage5，Fig 2D）.以后突起更加密集，培养4～6 wk时，多数细胞开始死亡.海马神经元培养 2 d时经40 g・L-1多聚甲醛固定，antiβtubulin免疫荧光染色鉴定，纯度在90％以上（Fig 2E）.
图 1纯化后星形胶质细胞 antiGFAP 免疫荧光染色（略） Fig 1AntiGFAP immunofluorescence of monolayer astrocyte（略）
2A-2D:Refer to 6，24 h;4，7 d respectively;2E: Refer to antiβtubulin immonofluorescence.
图2体外培养不同时间海马神经元的形态观察（略）
Fig 2Rat hippocampal neuron in vitro at different cultural time（略）
3讨论
神经元体外培养模型是神经元发育分化，神经再生，神经疾病的发生机制等众多研究领域的重要模型.由于体外培养的神经元在缺乏外源性神经营养因子的情况下，存活率与接种的细胞密度尤为相关，接种密度小于（7～10）×103 ・cm-2时，神经元很难存活［３，４］.而细胞密度高时神经元间突起互相交错而不便于观察单个神经元体外发育过程中树突，轴突，生长锥，突触等亚细胞结构的变化.20世纪80年代初，Goslin和Banker 建立了神经元低密度培养方法，其特点是采用星形胶质细胞与神经元立体共培养，可以支持神经元在低密度培养条件下存活，可能与星形胶质细胞能分泌某些促神经元存活生长的因子有关，其具体机制尚不清楚.该方法在国际上广泛采用，已被用于观察单个神经元的发育成熟，极性化和轴突形成；观察突触形成、突触功能的电生理研究；受体功能和信号转导机制的研究等［５］.我们建立海马神经元的低密度培养方法，目的是用于Nogo分子的功能研究.Nogo分子于2000年初克隆，广泛表达于中枢神经系统的寡突胶质细胞与神经元中，被认为与轴突生长关系密切［６］.
海马皮层在胚胎期和新生早期85%-90％为锥体细胞，锥体细胞在E15时开始发育，E18～19几乎发育完全，而齿状回颗粒细胞很少开始发育.选取E18～19大鼠海马皮层为培养材料，细胞均质性好［７，８］.同时以含N2的无血清培养液，可抑制胶质细胞分裂增殖，神经元纯度高.P2～5时，胶质细胞处在发育的高峰，而神经元较难在体外存活［１，２］，以P2～5大鼠大脑皮层为实验材料培养纯化的星形胶质细胞纯度在95 ％以上，这样可排除其他细胞的影响，便于实验条件的稳定.
我们参照原有方法，成功培养出海马神经元并对进行了形态学观察，其体外发育分为明确的5个阶段，每个阶段具有特定的形态学特征.我们可利用海马神经元的体外发育特点，并结合其发育过程中一些特异分子的表达分布［９－１１］，观察Nogo分子在海马神经元体外不同发育阶段的亚细胞表达分布变化模式，及在给予体外干预因素后，神经元在形态和分子表达模式上的反应，为今后的相关研究奠定了基础.
参考文献
［1］Goslin K， Banker G.Rat hippocampal neurons in low density culture［A］. In: Banker G， Goslin K.Culturing nerve cells［M］. Cambridge， MA: MIT.1991: 252281.
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［11］Goslin K， Schreyer DJ， Skene JH， Banker G .Changes in the distribution of GAP43 during the development of neuronal polarity［J］. J Neurosci， 1990；10: 588-602.转贴于