作者：李莹，韩炯，王立峰，林树新，药立波，俞强，刘新平
【关键词】 胃肿瘤
【Abstract】 AIM: To analyze the characteristics of the anoikis resistance of human gastric cancer cell lines（HGC27， BGC823， MGC803 and SGC7901）. METHODS: The growth conditions of the cells were observed by soft agar colony formation assay， DNA laddering assay and flow cytometry assay after the gastric cancer cells were cultured in suspension. RESULTS : The MDCK cells as control group， which were derived from normal canine kidney， did not grow in soft agar and no cell colony was formed. The DNA ladder， the marker of apoptosis， appeared 15 h after the cell culture in suspension and the FCM assay showed that the cells had sub-G1 phase of cell cycle 24 h and 48 h after cell culture in suspension. But in the case of the other four gastric cancer cell lines (HGC27， etc)， though different sizes of colon were observed when the cells were cultured in softer agar， there was no DNA ladder 15 h after the cell culture in suspension. By FCM assay， no significant difference was found between the cell cycle of suspensive cells and that of the control cells cultured in adhesion and no sub-G1 phase was observed. CONCLUSION: The MDCK cells are anchorage independent and the phenomena of anoikis can be observed. The four gastric cancer cells， HGC27， BGC823， MGC803 and SGC7901， are generally resistant to anoikis.
【Keywords】 stomach neoplasms;tumor cells，cultured；anoikis
【摘要】 目的: 研究胃癌细胞HGC27， BGC823， MGC803， SGC7901抗脱落凋亡的特性.为研究肿瘤细胞抗脱落凋亡的机制奠定基础.方法： 应用软琼脂集落形成实验，DNA ladder检测，流式细胞术等技术观察胃癌细胞脱落培养后细胞生长状况的改变.结果： 对照组细胞MDCK（狗的正常肾脏上皮细胞系）在软琼脂中不生长，没有形成细胞集落；悬浮培养15 h后，可见有细胞凋亡特征性的DNA ladder出现；流式细胞仪检测，悬浮培养24，48 h可见有凋亡峰出现.而HGC27等4种胃癌细胞系在软琼脂中均形成大小不等的细胞集落，脱落培养15 h后，没有细胞凋亡特征性的DNA ladder出现，流式细胞仪检测，与贴壁培养的对照组相比细胞周期没有显著性差异，也没有凋亡峰的出现.结论： MDCK细胞属于锚着依赖性细胞，可出现脱落凋亡.胃癌细胞HGC27， BGC823， MGC803， SGC7901属于抗脱落凋亡细胞.
【关键词】 胃肿瘤；肿瘤细胞，培养的；脱落凋亡
0引言
不具备转移特性的实体瘤细胞和正常上皮细胞进入血流后会因失去基质的支持而发生凋亡，这一现象称为脱落凋亡（anoikis）［１，２］.除上皮和内皮细胞外，骨骼肌细胞，某些低致瘤潜力的黑色素瘤细胞以及胚胎成纤维细胞也表现出脱落凋亡现象［３］.脱落凋亡的意义在于防止这些脱落的细胞种植于其他不适当的地方.然而，很多肿瘤细胞，尤其是容易发生转移的恶性肿瘤细胞，从瘤体上脱落后并不会发生凋亡，而是可以迁徙到其他部位再次生长.这种存在于某些肿瘤细胞中的抗脱落凋亡现象，被认为是肿瘤发生转移的重要原因之一.因此，研究肿瘤细胞抗脱落凋亡的信号转导机制，已经成为近年来肿瘤治疗方面基础与临床研究的一个重要内容.本研究旨在以胃癌细胞为研究对象，分析其抗脱落凋亡的特性，为进一步研究肿瘤细胞的抗脱落凋亡的信号转导通路的异常奠定基础.
1材料和方法
1.1材料人胃癌细胞株BGC823， HGC27：中科院上海细胞库；SGC7901，MGC803：西安西京医院消化内科全军重点实验室惠赠；MDCK细胞(狗的正常肾脏上皮细胞系)：美国波士顿大学医学院肺研究中心俞强教授惠赠；RPMI 1640培养基：Gibco公司；新生牛血清：杭州四季青生物工程公司；PolyHEMA: Sigma公司；FACSCalibur流式细胞仪：BD公司.
1.2方法
1.2.1细胞脱落培养模型的建立参照文献［１］的方法，将10 g・L-1溶于无水乙醇的polyHEMA 2 mL铺于55 mm的Petri 培养皿中，室温干燥，重复上述步骤一次.使用前用1×PBS洗4遍，紫外线消毒，消化细胞，计数，1×106细胞接种于60 mm polyHEMA包被的petri培养皿中.由于polyHEMA不带电荷，细胞无法贴壁，只能在培养皿中悬浮生长，借此来模拟细胞的脱落培养状态，对照组细胞为贴壁培养的细胞.所有细胞都采用含100 mL・L-1小牛血清的RPMI1640培养基，置于37℃含50 mL・L-1 CO2的细胞培养箱中培养.
1.2.2软琼脂集落形成实验配制底层5 g・L-1软琼脂，顶层3 g・L-1软琼脂的生长体系，接种7×1010・L-1个细胞于顶层软琼脂，CO2培养箱中培养2 wk，观察集落生长情况，统计，照相.
1.2.3DNA ladder 检测脱落培养15 h后收集细胞，加入600 μL 细胞裂解液（10 mmol・L-1 Tris Cl， pH 76， 10 mmol EDTA， 5 g・L-1 Triton X100），苯酚氯仿抽提3次，提取胞质的DNA，乙醇沉淀，凋亡的细胞会有断裂的DNA片段漏出到胞质，12 g・L-1琼脂糖凝胶电泳观察是否出现特征性的细胞凋亡的DNA ladder.
1.2.4流式细胞术检测凋亡细胞脱落培养8，24，48 h后，分别离心收集细胞，PBS洗涤2次，700 mL・L-1无水乙醇固定细胞，送检前，PBS洗涤2次，弃除无水乙醇.PI染色后，流式细胞仪检测凋亡峰及细胞周期的改变.
2结果
2.1脱落培养细胞的形态学观察MDCK细胞悬浮培养时，细胞多呈散在的单个细胞，也有少量聚集在一起，由2~5个细胞组成的细胞团，细胞团比较松散，随着培养时间的延长，镜下观察可以看见一些凋亡的细胞.HGC27，BGC823，MGC803，SGC7901细胞脱落培养7 h以后，细胞开始聚集，24 h后细胞相互聚集成比较大的团快，培养时间越长，聚集成的细胞团快越致密.
2.2软琼脂集落形成实验观察细胞的抗脱落凋亡 HGC27，BGC823，MGC803，SGC7901细胞在软琼脂培养2 wk均可形成多个、比较大的细胞集落，SGC7901的细胞集落略小，可能与该细胞在软琼脂的生长速度有关.MDCK细胞培养2 wk后，镜下观察，仍然是单个细胞，没有集落的形成，有的细胞已死亡 (Fig 1) .
A：MDCK；B：BGC823；C：HGC27；D：MGC803；E：SGC7901.
图1软琼脂集落形成实验（略）
Fig 1Soft agar colony formation assay（略）
2.3细胞脱落培养15 h后DNA ladder 检测悬浮培养MDCK细胞15 h后，出现了细胞凋亡特征性的DNA ladder .另4种胃癌细胞则没有这种现象，仅有大片段的DNA产生，与贴壁培养的对照组细胞相比没有明显的区别（Fig 2）.
2.4流式细胞仪观察脱落培养后细胞周期的变化及凋亡MDCK悬浮培养24，48h均有凋亡峰出现，HGC27，BGC823，MGC803，SGC7901脱落培养7，24，48 h细胞周期没有显著的改变，也没有凋亡峰的出现(Fig 3).
1：MDCK；2：BGC823；3：HGC27；4：MGC803；5：SGC7901.
A: Attached cells; S: Suspended cells.
图2细胞培养15 h后DNA ladder检测（略）
Fig 2DNA ladder assay after cells were cultured 15 datt: Attached cells；sus: Suspended cells; ■：G0-G1；□：S；□：G2-M；□：Apoptosis.（略）
Fig 3Cell cycle changing of the SGC7901，BGC823，MGC803，HGC27 cells cultured after 8，24，48 h by the FCM（略）
3讨论
细胞的增殖，分化和凋亡的动态平衡维持着细胞和组织的自稳态.脱落凋亡凋亡的一种特殊类型，是由于细胞与基质之间的不适当或不充分的相互作用而引起的，其主要作用是维持高度更新的上皮组织中细胞的正确数量.脱落凋亡平衡的打破可以引起上皮细胞脱离基质后存活时间延长，更易于游走，迁移到远端组织，并再贴壁，种植，生长.脱落凋亡平衡的紊乱往往引起肿瘤的远端转移.奇怪的是抗脱落凋亡不仅发生在癌组织，如：乳腺癌［4］、肺癌［５］、肠癌［６］，也发生在非上皮来源的肿瘤细胞，比如：成神经细胞瘤等［７］.不同类型的肿瘤细胞，其抗脱落凋亡的机制应该是有所不同的.目前的实验研究认为，肿瘤细胞的抗脱落凋亡机制可能与下列因素有关.① 蛋白激酶的信号途径，比如：整合素介导的相关激酶信号转导通路：PI3 kinase相关的信号途径；RafERK相关的信号途径；Jun Nterminal 激酶途径.② 细胞骨架的作用.③ 死亡受体的作用［8，9］.
我们以胃癌细胞系HGC27，BGC823，MGC803，SGC7901为研究对象，分析其抗脱落凋亡的特性，为进一步研究肿瘤细胞的抗脱落凋亡的信号转导通路的异常奠定基础.我们的实验发现：来源于狗的正常肾脏上皮细胞MDCK细胞悬浮培养时，细胞多呈散在的单个细胞，随着培养时间的延长，出现了一些凋亡的细胞.HGC27等胃癌细胞系脱落培养时，细胞多聚集成大小不一的细胞团，培养时间越长，细胞团越大，所形成的细胞团越致密.以上现象说明，MDCK 细胞必须黏附于基质，才能生存、生长，脱落培养以后发生了凋亡，属于脱落凋亡敏感的细胞.而HGC27等胃癌细胞系脱离基质后，仍然可以存活生长，具有抗脱落凋亡的特性.但这些细胞皆黏附在一起成比较大的细胞团，此现象提示：脱落培养的细胞的生长还是需要依赖于细胞与细胞之间的相互作用来代替失去的细胞外基质的信号刺激.为了排除细胞外基质及细胞与细胞相互作用的影响，我们用软琼脂克隆实验来观察细胞单个培养时的生长状况.实验发现：MDCK在软琼脂中培养2 wk后，细胞仍是单个，有的细胞已死亡.HGC27等胃癌细胞系在软琼脂中培养2 wk后，形成了许多的大小不等的细胞集落.我们进一步进行DNA ladder检测发现:细胞脱落培养15 h后， MDCK细胞出现了典型的细胞凋亡特征性的DNA ladder，而HGC27等胃癌细胞系没有出现此现象，只有少量的DNA大的片段，与对照组没有差异.流式细胞术观察，MDCK脱落培养24，48 h都出现了凋亡峰，而胃癌细胞脱落培养7，24，48 h其细胞周期与贴壁培养的对照组相比，没有显著差异，也没有出现凋亡峰.以上的实验结果都证明：MDCK细胞属于脱落凋亡敏感的细胞，而HGC27， BGC823， MGC803， SGC7901 脱落培养后仍可以生存，可以非贴壁依赖性生长，属于抗脱落凋亡细胞.
我们首次观察了HGC27等胃癌细胞系的抗脱落凋亡特性，筛选出了4株抗脱落凋亡的胃癌细胞系 : HGC27，BGC823，MGC803，SGC7901.但胃癌细胞的抗脱落凋亡的分子机制仍然不是很清楚，上述细胞株的发现及获得为我们进一步研究抗脱落凋亡的分子机制提供了很好的细胞模型.
【
参考文献
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