作者：张丰 李青 章必成 叶菁 陈广生 王莉 林圣彩
【关键词】 细胞周期，
关键词: 调节子;G蛋白;转染;细胞周期
摘 要:目的 探讨G蛋白调节子16（RGS16）对大鼠胶质瘤C6细胞的生物学特性的影响. 方法 利用脂质体介导法将RGS16基因导入C6细胞中，在倒置显微镜下观察细胞形态变化和贴壁情况;3 H-TdR法检测C6细胞在转染不同梯度pCMV5-RGS16和pCMV5质粒后的增殖情况;免疫细胞化学法检测转染前后RGS16蛋白的表达情况;流式细胞仪检测转染pCMV5-RGS16和pCMV5质粒36h后细胞周期变化和细胞是否有凋亡发生. 结果 转染pCMV5-RGS16质粒24h后30%细胞贴壁性降低，突起收缩，细胞变圆;RGS16蛋白表达阳性;3 H-TdR法检测显示C6细胞增殖速度与转染pCMV5-RGS16的量呈正相关;细胞周期结果显示G1期细胞百分数减少10%，而S期细胞百分数增多14%;未发现RGS16与凋亡有直接关系. 结论 RGS16可能促进C6细胞的增殖.
Keywords:regulon;G-proteins;transfection;cell cycle
Abstracts:AIM To study the effect of RGS16on the bio-logical characteristics of glioma C6cells.METHODS pCMV5-RGS16was transfected into C6cells by lipofectin.The morphological and adhesive changes of the cells were ob-served under an inverted microscope.Proliferation of C6cells was measured by3 H-thymidine（3 H-TdR）assay after gradi-ent transfections of pCMV5-RGS16and pCMV5.Expression of RGS16was examined by immunocytochemical method both before and after the transfection.Flow cytometry was adopt-ed to measure changes in the fraction number of the cell cycle phase and to detect whether RGS16could induce apoptosis of C6cell.RESULTS 24hours after the transfection of pCMV5-RGS16approximately30%of C6cells grew round and13%expressed RGS16;36h later the positive relation-ship between the proliferation of C6cells and the gradient transfections of pCMV5-RGS16was displayed by3 H-TdR as-say.Flow cytometry showed that the fraction number of G1phase of C6cells reduced by10%and that of S phase accu-mulated by14%and RGS16could not induce apoptosis of C6cells.CONCLUSION RGS16might promote the prolifera-tion of C6cells.
0 引言
G蛋白在丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-acti-vated protein kinases，MAPK）引起细胞增殖和分化的信号转导过程中起重要调控作用［1］ .G蛋白调节子（regulators of G protein signaling，RGS）是近年来新发现的参与G蛋白信号转导的一个大家族，主要功能是负调节Gαi和Gαq亚基，其成员超过20种［2］ .1997年我们［3］ 在小鼠垂体内克隆了RGS16，并发现其在肝、垂体和脑组织内表达丰富.最近发现RGS16可能参与细胞的应激反应［4-7］ .根据文献检索RGS16在胶质瘤中的作用尚未见报道，因此，我们将外源性基因RGS16导入C6细胞，观察其对细胞的影响，为确定RGS16蛋白的功能和其在C6细胞信号转导中的作用提供依据.
1 材料和方法
1.1 材料 大鼠胶质瘤细胞C6:本室保存;pCMV5-RGS16，pCMV5和RGS16抗体:新加坡国立大学林圣彩教授惠赠;脂质体:Gibco公司;3 H-TdR:上海原子能研究所;免疫组化试剂盒:武汉博士德公司;DNA-Prep试剂盒:美国Coulter公司.
1.2 方法
1.2.1 基因转染［8］ C6细胞在含150mL・L-1 小牛血清的RPMI1640培养液中常规培养，细胞生长至对数期时以1×105 /孔接种于6孔培养板.将pCMV5-RGS163μg和脂质体10μL分别溶于无血清培养液100μL，两溶液缓慢混匀，室温放置30min，加入无血清培养液0.8mL，混匀后加入上述6孔培养板中，常规培养4h后，每孔加入含150mL・L-1 小牛血清的RPMI1640培养液2mL.同样方法转染pCMV5作为对照.只加脂质体每孔10μL和未处理组各3孔作为阴性对照.阳性率计算:在随机一显微镜视野下，阳性率=RGS16蛋白表达阳性的细胞数×100%/总细胞数.转染24h后分别在倒置显微镜下观察细胞的形态变化.
1.2.2 3 H-TdR掺入法［9］ 取对数生长期细胞，消化后制成1×109 ・L-1 细胞悬液，按每孔100μL接种于96孔培养板，培养4h，细胞贴壁.将pCMV5-RGS16和pCMV5质粒分别按4组不同梯度（90，180，270，360ng/孔），与0.8μL脂质体分别溶于25μL无血清培养液，每个梯度3孔，两溶液缓慢混匀，室温放置30min，混匀后加入上述已接种细胞的96孔培养板中，24h后每孔加3 H-TdR1.85×104 Bq（50μL），继续培养12h，吸取上清液，PBS洗涤3次后测3 H-TdR掺入率.
1.2.3 免疫细胞化学染色 转染同时制备细胞爬片，转染后36h取出，PBS洗涤2次×3min;950mL・L-1 乙醇固定30min，加兔抗鼠RGS16抗体（1∶50），4℃过夜，PBS洗涤3次×5min;加入即用型羊抗兔，室温放置30min，PBS洗涤3次×5min;加入SABC复合物，室温放置30min，PBS洗涤3次×5min;DAB显色，苏木精衬染.
1.2.4 细胞周期和凋亡分析 36h后取4组细胞各约1×106 个，经胰酶消化制成单细胞悬液，离心2次，每次PBS4mL洗涤.700mL・L-1 乙醇固定，DNA染色后用流式细胞仪检测细胞周期变化和是否有凋亡峰出现.
统计学处理:采用t检验进行统计学分析.
2 结果
2.1 细胞形态变化 转染pCMV5-RGS1624h后，倒置显微镜下显示细胞贴壁性降低，突起收缩，细胞变圆.对照组未见明显变化（Fig1）.
2.2 3 H┐TdR掺入法 转染pCMV5-RGS16组放射值随转染质粒DNA量的增加而明显升高.转染pCMV5组放射值变化不明显.统计表明两组之间有显著差异（P&<0.01，Tab1）.
表1 pCMV5-RGS16组和pCMV5组不同梯度的3 H-TdR值 略
2.3 免疫细胞化学 转染pCMV5-RGS16组RGS16蛋白表达阳性（阳性率13%，Fig2）;转染pCMV5组脂、质体组和未处理组RGS16蛋白表达阴性.
2.4 细胞周期和凋亡分析 转染pCMV5-RGS16组细胞周期G1期细胞比例减少，S期增多.pCMV5组、脂质体组和未处理组细胞周期变化不明显（Tab2）.未发现有凋亡峰出现.
表2 流式细胞仪检测各组细胞周期 略
3 讨论
RGS蛋白家族是一组含有约120个氨基酸在进化上很保守的RGS结构域的蛋白质.它们主要直接与G蛋白的Gαi和Gαq亚基结合，通过上调G蛋白α亚基的GTP酶活性，促进G蛋白α亚基和βγ亚基的结合，从而负调节G蛋白的活性，并间接负调节G蛋白对MAPK的激活［2］ .1997年我们
［3］ 在小鼠垂体克隆了RGS16并发现其可以代替酵母细胞中一种RGS蛋白SST2的功能，使停滞于G1期的酵母细胞恢复增殖状态.后来我们［4］ 又发现RGS16可以减弱血小板激活因子对p38MAPK的激活作用;并且在CEM细胞中蛋白激酶C可以通过上调TNF-α而诱导RGS16的表达［5］ .Buckbinder等［6］ 和Beadling等［7］ 曾分别发现p53和IL-2也可以诱导RGS16的表达.因此我们推测RGS16可能参与细胞的凋亡和应激反应.我们将pCMV5-RGS16转入C6细胞后，发现细胞贴壁性降低，星状突起收缩，细胞变圆;36h后RGS16蛋白表达阳性;3 H-TdR掺入法结果显示RSG16明显促进C6细胞的增殖;流式细胞仪结果表明RGS16促进了G1期的细胞加快向S期过渡，使G1期细胞百分数下降而S期细胞百分数增加;但实验结果未发现RGS16与凋亡的直接关系.
本研究表明，RGS16可以促进胶质瘤C6细胞的增殖，有类似SST2在酵母细胞中的作用［3］ .由于SST2通过下调G蛋白活性从而减弱主要通过RAS/RAF/MAPK通路传递到细胞核内的信号，使Cln1p-Cdc28和Cln2p-Cdc28活化，促进细胞增殖［10］ .因此我们推测RGS16也可能通过间接调节Cdc28而调节C6细胞周期的运行.但由于哺乳动物细胞信号转导的复杂性以及胶质瘤C6细胞内基因突变造成信号转导通路与正常细胞之间的差异性［11］ ，因此也不能 排除RGS16通过其他信号转导通路调节C6细胞周期的运行.由于本实验未发现RGS16与凋亡的关系，因此RGS16与p53，p38MAPK，TNF-α以及IL-2之间的关系在细胞增殖和凋亡中的作用还有待于进一步探索.
参考文献
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