关于增生性瘢痕C┐myc和C┐fos蛋白的表达

作者：毋巨龙　李荟元　李世荣


【关键词】 癌基因，
　　关键词: 瘢痕，肥大性;癌基因;免疫组织化学;图像处理，计算机辅助
　　
　　摘 要:目的 了解癌基因C-myc和C-fos蛋白产物在瘢痕中的表达情况，探讨瘢痕增生机制. 方法 采用免疫组织化学方法对增生性瘢痕（HS）、非增生性瘢痕（NHS）和正常皮肤标本各9例进行癌基因C-myc和C-fos蛋白产物的检测，并采用图像分析法进行比较. 结果 癌基因C-myc和C-fos蛋白产物在增生性瘢痕胶原结节和漩涡状结构中的成纤维细胞中呈强阳性表达，图像分析结果面密度（C-myc:0.0438±0.0035vs0.0036±0.0004，0.0035±0.0005，P&<0.01;C-fos:0.0525±0.0086vs0.0054±0.0014，0.0053±0.0023，P&<0.01），平均灰度（C-myc:82295±625vs14311±89，6927±745，P&<0.01;c-fos:50484±3665vs10424±1422，16585±1321，P&<0.01），积分吸光度（C-myc:2.34±0.41vs0.42±0.06，0.40±0.05，P&<0.01;C-fos:4.31±0.35vs0.62±0.07，0.58±0.04，P&<0.01）等指标经统计学处理与非增生性瘢痕和正常皮肤有显著差异. 结论 癌基因C-myc和C-fos蛋白产物可能与瘢痕的增生相关.
　　
　　Keywords:cicatirix，hypertrophic;oncogenes;immunohis-tochemistry;image processing，computer-assist-ed
　　
　　Abstract:AIM To explore the localization of proto-onco-gene C-myc and C-fos products in hypertrophic and non-hy-pertrophic scars and in skin tissues.METHODS Respective9specimens of hypertrophic and non-hypertrophic scars and skin tissues were stained with immunohistochemical method for C-myc and C-fos products and to compare the expressions of C-myc and C-fos in human hypertrophic scar tissues with normal dermis and non-hypertrophic scars through Morpho-metric analysis.RESULTS Result demonstrated significant numbers of fibroblasts，endothelial cells were positively stained for C-myc and C-fos in nucleus and in cytoplasm;there were statistically significant differences among hyper-trophic scar，norhypertrophic scar and skin tissues（from morphometric analyses）.Were as follows:Results got area densities（pixel・μm-2 ）C-myc:0.0438±0.0035vs0.0036±0.0004，0.0035±0.0005，P&<0.01;C-fos:0.0525±0.0086vs0.0054±0.0014，0.0053±0.0023，P&<0.01;grey level values，C-myc:82295±625vs14311±89，6927±745，P&<0.01;C-fos:50484±3665vs10424±1422，16585±1321，P&<0.01and integral absorbances，C-myc:2.34±0.41vs0.42±0.06，0.40±0.05，P&<0.01;C-fos:4.31±0.35vs0.62±0.07，0.58±0.04，P&<0.01）.CONCLU┐SION Oncogene C-myc and C-fos protein products may be related to the pathogenesis of the hypertrophic scar.
　　
　　0 引言
　　
　　增生性瘢痕（hypertrophic scar，HS）是烧伤及其他原因所致皮肤损伤后出现的过度愈合反应，最终形成病理性皮肤纤维化的结果［1-3］ .它以过度的以胶原为主的细胞外基质合成和堆积，持续的瘢痕增生和挛缩为特征，目前HS的发生机制尚未完全清楚.TGF-β是近年来备受关注的细胞生长因子［4］ ，可以促进胶原合成和减少胶原降解，从而促进细胞外基质堆积.近年研究表明，TGF-β致细胞外基质堆积可能是通过癌基因编码的核蛋白转录因子起作用的.原癌基因C-myc和C-fos的表达与细胞生长，分化和启动细胞的增殖活性密切相关.我们采用链酶菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接法免疫组织化学法，对C-myc和C-fos蛋白产物在活体内增生性瘢痕、非增生性瘢痕（NHS）和皮肤组织中的分布进行了研究，并用计算机图像分析比较其差异.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 HS组9（男3，女6）例，年龄18～50岁.所有病例均是深度烧伤后瘢痕增生，局部有瘙痒，瘢痕潮红，高出皮肤，触之较硬，瘢痕增生局限于皮损区，部位包括面部、上肢和下肢，时间在创伤愈合后5～18mo;NHS组9（男2，女7）例，年龄16～45岁.致伤原因为烧伤和外伤，瘢痕接近正常皮肤颜色，触之较软，轻微高出或未高出皮肤，局部无瘙痒症状.部位包括面部及颈部，时间在2a以上;正常皮肤组:9例，均取自上述病例股部供皮区，为手术植皮修剪后残余皮片.以上病例既往无任何慢性病史，术前半年内均未用过激素类药物，肝肾功能等检查无异常.取材前都向患者说明目的并征得同意.
　　
　　1.2 方法 上述瘢痕及皮肤组织取下后，取边缘0.7cm×1cm大小全厚组织块用40g・L-1 甲醛固定24h，石腊包埋，连续切片4张，片厚5μm，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接法对上述切片分别做C-myc和C-fos蛋白产物免疫组化染色.半数切片脱水固定，中性树胶封片，留待做图像分析.其余切片苏木素复染，常规脱水固定，中性树胶封片.阴性对照片用PBS置换一抗.免疫组化染色切片在光镜下观察.随机抽取HS，NHS和皮肤3组中C-myc和C-fos染色组织片各4张，用CMIA007真彩色图像分析系统，在显微镜×10放大倍数下每组随机取10个视野分别测定阳性目标总个数、总面积，统计场总面积，以面密度（pixel・μm-2 ），平均灰度，积分吸光度为指标进行半定量分析.
　　
　　统计学处理:图像分析数据按x ±s表示，进行t检验.
　　2 结果
　　
　　2.1 C┐myc和C┐fos蛋白的分布 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接法免疫组化阳性染色信号为棕黄色颗粒，阴性对照片无棕黄色着色.在正常皮肤组织中，C-myc和C-fos蛋白产物主要分布于表皮基底层细胞，小血管内皮细胞，皮脂腺及毛囊上皮细胞，胞核及胞质均有着色（Fig1，2）.在HS组织中，除表皮基底层细胞、小血管内皮细胞染色阳性外，在胶原结节、漩涡状结构中的成纤维细胞中呈阳性着色，密度高、着色浓（（Fig3，4）.在NHS组织中，C-myc和C-fos蛋白分布于表皮基底层细胞，但分布密度及着 色较HS组织淡而稀少，成纤维细胞中C-myc和C-fos蛋白阳性分布很少（（Fig5，6）.
　　
　　2.2 组织切片图像分析结果 C-myc和C-fos阳性分布的面密度、平均灰度和积分光密度以HS组织中最高，NHS和皮肤组织中低（P&<0.01，Tab1）.
　　
　　表1 增生性瘢痕中C-myc和C-fos图像分析结果　略
　　
　　3 讨论
　　
　　早期基因C-myc和直接早期基因C-fos都是编码核蛋白的癌基因.它们的产物具有转录调节作用［5］ 、介导细胞由静止期向增殖期转化并在伤口愈合中起作用［6］ .C-myc在硬皮病受损皮肤中成纤维细胞中表达明显增高，可能与成纤维细胞激活有关［7］ .本结果显示C-myc和C-fos蛋白产物主要分布于基底层细胞，血管内皮细胞以及增生性瘢痕组织的成纤维细胞中，这些细胞均是功能活跃的细胞:基底层细胞是皮肤组织中有丝分裂和新陈代谢最为活跃的细胞，血管内皮细胞可合成内皮素等许多细胞因子，成纤维细胞是皮肤组织中胶原合成的主要来源，C-myc和C-fos的表达可能与这些细胞功能有关.成纤维细胞是皮肤伤口愈合和瘢痕增生的关键细胞，C-myc和C-fos在HS组织中强阳性表达，提示它们的表达可能在瘢痕增生中起重要作用. 　　C-myc和C-fos mRNA和蛋白在成纤维细胞中只有很短的半衰期［8］ ，在受刺激后C-fos mRNA和C-myc mRNA表达高峰分别为30min和3h.在HS组织中，持续存在的有较高水平的C-myc和C-fos蛋白只能是源于丝裂原刺激下不断地合成所致.在增生性瘢痕组织中，成纤维细胞Ⅰ，Ⅲ型前胶原mRNA表达增高，并有TGF-β1 mRNA表达增高，邻近的单核细胞、血管内皮细胞TGF-β1 mRNA呈强阳性表达.另外TGF-β1 蛋白免疫组化染色不仅在成纤维细胞和内皮细胞中为强阳性分布，而且在细胞外基质中也呈强阳性表达，提示TGF-β1 可能是通过自分泌或旁分泌方式刺激胶原合成，TGF-β1 持续存在于基质中不断地刺激胶原合成.另外的实验也发现在烧伤后瘢痕组织中Ⅰ，Ⅲ型胶原和TGF-β1 mRNA平行地表达增高［9，10］ .以上实验结果不仅为TGF-β1 刺激以胶原为主的细胞外基质的合成提供了间接证据，而且表明在HS组织中持续存在着有较高水平的TGF-β.我们推测增生性瘢痕组织中高水平的TGF-β不断地刺激C-myc和C-fos的表达，并促进胶原的合成，致使瘢痕增生.我们在另外的实验中体外HS组织成纤维细胞培养结果显示TGF-β1 可促使胶原合成分泌率提高2.0倍，同时可大大提高C-myc和C-fos表达［11］ .结果进一步验证了我们的上述推测，即TGF-β1 可能是通过促进C-myc和C-fos的表达而调节胶原基因的转录，进而增加胶原的合成与分泌.
　　
　　图1 － 图6 略
　　参考文献:
　　
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