作者：秦立篷，李丁，张菊，韩锋产，阎小君
【关键词】 幽门螺杆菌
关键词: 幽门螺杆菌;尿素酶B基因;大肠杆菌
摘 要:目的 克隆幽门螺杆菌ureB基因，并进行表达，验证表达产物的反应原性. 方法 应用PCR技术从临床分离株中扩增出ureB基因，克隆入载体pGEM-7zf（+）进行测序，进一步转到大肠杆菌表达载体pBV220进行诱导表达，以Western blot实验验证重组蛋白的反应原性. 结果 测序后经同源性比较，证实扩增后得到的片断确为ureB基因，并原核表达出可被抗Hp抗体识别的非融合重组蛋白. 结论 获得了有反应原性的重组UreB蛋白.
Keywords:Helicobacter pylori;urease B gene;E.coli
Abstract:AIM To clone and to express the ureB gene of Helicobacter pylori and analyse the reactionogenicity of the recombinant ureB.METHODS H.pylori ureB fragments were amplified by PCR，then the DH5?was transformed by pBV220/ureB after sequencing and BLAST.The reactiono-genicity of the recombinant UreB was detected by Western-blot.RESULTS H.pylori ureB fragments were subse-quently cloned into the prokaryotic expression vector pBV220after sequencing（The result showed that96%of the DNA se-quences we had got were the same as that of M60398，so they were the right gene we wanted）.Then the DH5?was trans-formed by pBV220/ureB，and the recombinant protein was induced by heat when temperature reached42℃.The molec-ular mass of the expressed UreB were conformed to that we anticipated.The form of the recombinant UreB were inclu-sion bodies in host bacteria.Western-blot showed that the recombinant UreB was expressed in DH5α/pBV220/ureB which could be recognized by anti-H.pylori antiserum.CONCLUSION Fragment of ureB is obtained，and it is ex-pressed in E.coli.
0 引言
H.pylori（Hp）能特异地产生活性很强的尿素酶.Hp尿素酶既是定植因子又是毒力因子［1］ ，有很强的抗原性［2］ .据此特点，人们发展了血清学方法来诊断Hp感染［3］ .Hp不易培养，要获得大量的Hp蛋白，需要进行重组表达.我们选择了尿素酶B亚基进行重组表达，并验证表达产物的反应原性.
1 材料和方法
1.1 材料 限制性内切酶（EcoRⅠ，HindⅢ），Taq DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、Rnase，DnaseI，低分子量蛋白marker，DNA Marker（DL2000）购自宝生物工程有限公司.QIA quick Gel Extraction Kit购自Qiagen公司.Wizard Plus Milipres DNA纯化试剂盒购自Promega公司.过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，DAB显色试剂盒购自博士德生物工程公司.羊Hp多克隆抗体购自DAKO公司.pGEM-7zf（+）质粒、pBV220质粒、大肠杆菌JM109，大肠杆菌DH5α均由本所保存.Hp临床分离株由第一军医大学周殿元教授、陈烨博士惠赠.
1.2 方法 以Hp临床分离株基因组DNA为模板，用PCR扩增Hp ureB基因.引物序列为引物1:5’-CCCGCGGAATTCATGAAAAAGATTAGCA-GAAAAGAATAT-3’，引物2:5’-GCCAAGCTTT-TACATCGCTTGAGAGTCAGAACT-3’.将扩增产物克隆入经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后的pGEM-7zf（+）载体，蓝白筛选后，再经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后选取阳性克隆，命名为pGEM-7Zf（+）/ureB-EH.由上海基康公司以全自动序列分析仪双向测定插入片段的序列，拼接出完整序列，进行BLAST分析.将pGEM-7Zf（+）/ureB-EH重组质粒用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后，回收约1098bp大小的基因片段，克隆入pBV220质粒相应的酶切位点，将以EcoRⅠ和HindⅢ双酶切筛选的阳性克隆命名为pBV220/ureB-EH.挑取重组表达质粒pBV220/ureB-EH转化的E.coli DH5α菌株，用含氨苄青霉素的LB培养基按1 100倍稀释接种，30℃振摇到对数增长晚期，42℃诱导5h.集菌后作120g L-1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳以鉴定重组蛋白的分子量和表达形式.Western blot实验验证重组蛋白的反应原性，以空pBV220载体转化的E.coli DH5α菌作为阴性对照.
2 结果
2.1 Hp ureB基因的克隆 用PCR扩增Hp ureB基因，扩增出1098bp的基因片段，克隆入pGEM-7zf（+）后，经蓝白筛选和酶切鉴定出阳性克隆，测序及BLAST分析结果表明与报道的序列同源性为96%，以该序列推导出的氨基酸序列与文献报道的完全相同（Fig1）.
2.2 重组表达质粒的构建 pGEM-7Zf（+）/ureB-EH重组质粒用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后，回收长度约1098bp的基因片段，克隆入pBV220质粒相应的酶切位点，以EcoRⅠ和HindⅢ双酶切筛选阳性克隆，酶切片段大小与预期相符，构建成功（Fig2）.
2.3 pBV220/ureB┐EH的诱导表达 诱导表达后集菌作120g L-1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定分子量和表达形式.可见34.3ku大小的蛋白表达（分子量与预期相符），主要以包涵体的形式存在于胞质中， 诱导4h后表达量趋于稳定.Western blot证实重组蛋白具有反应原性（Fig3～5）.
图2 － 图4 略
3 讨论
在Hp的致病过程中有多种致病因子参与，其中尿素酶被证实是少数几种与Hp感染密切相关的蛋白，具有极高的尿素酶活性，是Hp重要的生物学特性之一［7］ .Hp尿素酶既是定植因子又是毒力因子，是Hp主要抗原之一.目前用裂菌提纯的尿素酶作为抗原的血清学诊断试剂盒已经商品化.血清学方法诊断Hp感染，其结果取决于所用抗原的种类和质量.尿素酶的亚单位ureA和ureB的表达产物均能诱导机体产生免疫反应，但后者的反应性更强［4］ .因此我们选择了ure B亚基重组表达，并验证了表达产物的反应原性.
图5 略
ure B亚基是目前疫苗研究和诊断用品的重要抗原.ureB的氨基酸序列非常保守，不会影响其作为诊断试剂的抗原.我们构建了ure B亚基重组表达载体pBV220/ureB-EH，目的在于获得大量可用于血清学诊断的重组蛋白.
参考文献
［1］Dunn BE，Cohen H，Blaser MJ.Helicobacter pylori ［J］.Clin Microbiol Rev，1997;10:720-741.
［2］Spreng S，Gentschev I，Goebel W，Mollenkopf H，Eck M，Muller-Hermelink HK，Schmausser B.Identification of im-munogenic antigens of Helicobacter pylori via the Escherichia coli hemolysin secretion system（1）［J］.FEMS Microbiol Lett，2000;186（2）:251-256.
［3］Leung WK，Chow TP，Ng EK，Chan FK，Chung SC，Sung JJ.Validation of a new immunoblot assay for the diagnosis of Heli-cobacter pylori in the Asian population ［J］.Aliment Pharmacol Ther，2001;15（3）:423-428.
［4］Gomez-Duarte OG，Lucas B，Yan ZX，Panthel K，Haas R，Meyer TF.Protection of mice against gastric colonization by Helicobacter pylori by single oral dose immunization with atten-uated Salmonella typhimurium producing urease subunits A and B ［J］.Vaccine，1998;16（5）:460-471.