作者：吕海侠，刘 勇，李敏杰，肖新莉，丁海燕，凌凤东
【关键词】 波形蛋白
关键词: 波形蛋白;胎儿;脑;人;免疫组织化学
摘 要:目的 研究不同发育时期人脑vimentin阳性细胞的形态特征及其分布情况. 方法 计划生育流产或引产的胚胎（9，13及28wk）大脑经多聚甲醛固定，石蜡包埋并连续切片，免疫组织化学染色，光镜下观察. 结果 免疫组织化学染色结果发现vimentin阳性细胞形态多样，大小不一，多呈圆形，分布广泛，特别是嗅球、海马、纹状体以及脑室下区均可见到vimentin阳性的细胞，并且随发育时期及部位不同，细胞形态及突起情况各异. 结论 vimentin阳性细胞形态及分布不同可能与发育阶段有关.
Keywords:vimentin;fetus;brain;persons;immunohis-tochemistry
Abstract:AIM To observe the morphology and distribution of vimentin positive cells in human fetal brain in different ges-tation weeks.METHODS Fetal brain（9，13and28weeks）were fixed with formaldyhydum polymerisatum and embeded with paraffin wax.Then，the morphology and distribution of the vimentin positive cells were observed after immunohis-tochemical staining.RESULTS Vimentin positive cells were distributed extensively and could be foud in all the re-gions of the fetal brain，especially in olfactory bulb，hip-pocampus，striatum and subventricular zone.The shapes and sizes of vimentin positive cells were different according to the different gestation weeks and different regions of the brain.Most of them were round with or without processes.CON┐CLUSION Different shapes and sizes of vimentin positive cells may be related to the special development stages.
0 引言
中间丝蛋白是介于微管和微丝之间的一种蛋白纤维，在神经系统发育过程中表达呈一定的顺序性.Vimentin蛋白即波形蛋白是中间丝蛋白的一种，表达于尚未发生终末分化的细胞，即神经干细胞（neural stem cell，NSC），神经祖细胞（progenitor）/前体细胞（precusor）.它们是神经系统发育不同时期的特定细胞群体，具有自我更新（增殖）和分化能力，是神经系统的储备细胞.这些细胞移植后可以发生增殖和分化，从而为治疗神经系统非再生性疾病开辟了一条新的途径［1-6］ .目前动物研究很多，但对于人胚胎神经干细胞，祖细胞/前体细胞形态和分布的研究尚少，我们选用9，13及28wk人胚脑，进行vimentin蛋白的免疫组织化学染色，以期通过研究vimentin阳性细胞形态特征及其分布情况来推测人胚胎大脑中神经干细胞、祖细胞/前体细胞形态和分布情况，从而为人神经系统发育研究和神经干细胞的培养、移植等应用研究奠定基础.
1 材料和方法
1.1 材料 分别将不同孕龄（9，13及28wk）的人胚脑各5例（标本由西安交通大学第二医院妇产科提供）用40g L-1 多聚甲醛固定，全脑或分不同部位［1］ 进行石蜡包埋，5μm连续切片，免疫组织化学染色.
1.2 方法 免疫组织化学染色采用SABC法，石蜡切片经脱蜡至水及抗原修复后，用正常血清封闭1h，与一抗小鼠抗人vimentin（Dako1 50）抗体共同孵育24～48h（4℃），PBS冲洗，再分别与二抗山羊抗小鼠IgG及SABC（武汉博士德）共同孵育2和1h，DAB显色.免疫组化染色阴性对照用0.01mol L-1 的PBS代替一抗，用正常山羊血清代替二抗，其余步骤不变.
2 结果
Vimentin阳性细胞多为圆形或椭圆形，部分细胞有突起，细胞形态、大小和突起情况随其存在部位和发育阶段不同而异，绝大部分细胞为胞质着色，有少数小细胞为细胞核着色.
2.1 孕早期胚胎大脑 全脑均有阳性细胞出现，分布的疏密程度因部位不同呈现一定的差异，细胞大小形态一致，均为圆形或椭圆形，不带突起，较小，胞质着色，核区呈空泡状，在即将形成侧脑室的部位细胞排列紧密、整齐并渐呈假复层（Fig1A），而中央管的室管膜细胞明显呈现假复层，且细胞向脑实质方向伸出较短的突起.除此之外，脉络丛，血管壁以及结缔组织均有阳性细胞出现.
2.2 孕中期胚胎大脑 阳性细胞分布范围相对局限，但大部分脑区仍可见阳性细胞，尤其是嗅球、海马、纹状体、室管膜以及脑室下区;细胞形态有所改变，部分细胞可见较短小突起;另外此期的许多脑区出现一种圆形呈现较淡染色的细胞，排列紧密，分布在一些阳性纤维之间（Fig1B）.
2.3 孕晚期胚胎大脑 阳性细胞分布范围进一步减小，而且细胞形态多样，多有突起，随部位的不同而不同，部分脑区可见大量的阳性纤维.脑室前壁和外侧壁vimentin阳性细胞呈现假复层结构，细胞大小均一，胞质着色，核空，部分细胞带有短小的单向丝状突起，伸向外界膜方向;内侧壁vimentin阳性细胞较少，几乎不可见完整的形态，但可见较薄的vimentin着色带，未见突起（Fig1C），脑室下区的阳性细胞与室管膜细胞大小相同，圈状，但多无突起.纹状体vi-mentin阳性细胞呈“戒指”样，胞核区为空泡，胞质着色，且局部着色较深，似戒面;细胞大小差别不大;周边部细胞向外伸出单根突起，且突起方向基本一致，中间有少部分细胞未见突起;除上述的阳性细胞之外，此处还可见部分阳性纤维（Fig1D）.海马部位的阳性细胞形态大小与上述各区相同，有突起，但分层排列，其中靠近脑室侧细胞较多，形态和大小一致，加杂有部分细胞的突起;靠近皮质侧同样以细胞为主，细胞排列较稀疏;中间一层则以突起为主，在整齐排列的突起纤维之间夹杂有零星的阳性细胞;细胞突起排列整齐，突起伸向脑室侧或皮质侧（Fig1E）.嗅球的阳性细胞数目较多，也呈“戒指”样，胞质着色，且着 色不匀，细胞大小基本相同，未见突起，可见部分阳性纤维.皮质的阳性细胞有两种不同的形态，一种细胞为圆形或椭圆形，体积与其它部位相同，大部分为胞质着色，少数为胞核着色，细胞突起较多，短小呈分枝状;而另一种细胞呈短棒状，体积约为大细胞的1/3，胞核着色，突起少.除此之外顶叶皮质还可见大量的阳性纤维，排列整齐，而颞叶皮质阳性纤维较少（Fig1F）.延髓可见大量的排列整齐的阳性纤维，几乎未见阳性细胞.
神经干细胞/祖细胞或前体细胞存在于胚胎和成年动物神经系统中，是新生神经细胞的“发源地”，对它的研究是神经科学研究的国际热点
［7-12］ .中间丝蛋白常作为神经系统发育的早期细胞的标志物用于研究，vimentin蛋白主要表达于尚未发生终末分化的细胞，即NSC以及神经祖细胞/前体细胞.Vimentin阳性细胞的形态分布反映大脑中的神经干细胞/祖细胞或前体细胞形态分布情况.在大脑发育过程中，中央管最终发育成成熟大脑的脑室系统，神经的生发层就处在脑及其周围，居于此处的生发细胞即干细胞可以进行有丝分裂，完成增殖和分化，形成较为成熟的神经元和胶质细胞，沿放射状纤维进入脑实质或迁移入特殊组织层［4］ ，这些具有分裂增殖功能的细胞源于中央管，存在于胚胎全脑及幼年动物的大部分脑区，并终生存在于成年动物及人脑的脑室系统、嗅球、海马、纹状体等部位，本结果与上述文献报道一致［1，2，4-6］ ;另外我们还发现脑室外侧壁和前壁的阳性细胞较多，而且排列呈假复层，这与发育中大鼠的nestin阳性细胞分布情况相同，并且符合神经管的组织学发生.
到目前为止未见有人对神经干细胞、祖细胞/前体细胞的形态进行系统研究，我们观察发现vimentin阳性细胞多为圆形或椭圆形，发育较早期细胞大小形态一致，除发育较早的中央管周围细胞外均无突起;孕晚期细胞随存在部位的不同带或不带突起，主要呈现下列几种形态:①细胞大，胞质着色，核区为空泡，无突起或仅有短小突起，主要出现在室管膜、室下带、嗅球和纹状体;②细胞大，胞质着色，核区为空泡，突起较长，主要见于海马;③细胞大，胞质着色，细胞核也着色，有短小突起，见于皮质;④细胞小，全细胞着色，突起短小但较密，主要存在于皮质深面.根据细胞形态和特点推测上述体积较大的细胞即为神经祖细胞/前体细胞，在脑室壁无突起的细胞位于神经上皮层，有突起细胞为套层细胞，细胞突起很长，一直可以延伸到脑表面，与软膜组织相连，既起支持作用也可引导神经元迁移;室管膜下区、嗅球以及纹状体大多数细胞无突起，少数细胞有短小突起，可能是这里的细胞更为原始［1-3］ ，也可能是与切片方向有关.海马区阳性细胞多，突起明显且排列整齐，这与海马特殊的板层样结构有关，突起是细胞间的联系，也可能是细胞由脑室侧向皮质侧迁移留下的痕迹.皮质区胞核着色的大细胞，可能是一种新的细胞类型，也可能是切片时未切到细胞核所致;体积小的细胞，根据形态推测可能是小胶质细胞，因为vimentin不仅表达于未分化的神经上皮和未成熟的星形胶质细胞，也可以表达于中胚层起源的细胞和反应性小胶质细胞，我们发现血管壁也有vimentin蛋白着色与此相符.
图1 略
参考文献:
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