【关键词】 水杨酸钠
关键词: 水杨酸钠;HL-60细胞;脱噬作用
摘 要:目的 研究水杨酸钠对HL-60细胞的影响. 方法 用MTT法检测水杨酸钠对HL-60细胞存活率的影响;光镜、电镜观察细胞形态学变化;流式细胞术分析DNA含量;An-nexin-V结合分析检测靶细胞磷脂酰丝氨酸外化. 结果 水杨酸钠明显抑制HL-60细胞生长，并呈时间、剂量依赖性;5mmol L-1 （IC50 ）的水杨酸钠作用后，HL-60细胞出现典型的凋亡形态特征，并检测到亚二倍体峰;同时，靶细胞磷脂酰丝氨酸外化率显著高于阴性对照组（0.24vs0.03）. 结论 水杨酸钠能抑制HL-60细胞生长并促进其凋亡.
Keywords:sodium salicylate;HL-60cells;apoptosis
Abstract:AIM To study the growth-inhibited and apopto-sis-triggered effect of sodium salicylate（Na-Sal）on HL-60cells.METHODS The viability of HL-60cells was mea-sured by MTT assay;the morphological changes were ob-served by light and eletronic microscope;DNA content was assayed by flow cytometry;and the phosphatidylserine（PS）exposure was detected by Annexin-V binding.RESULTS Na-Sal was effective in inhibiting the growth of HL-60cells in a dose-and time-dependent manner.HL-60cells treated by Na-Sal with a concentration of5mmol L-1 （IC50 ）were typical of apoptotic morphology，with aneuploid peak detect-ed.Meanwhile，the phosphatidylserine exposure rate of tar-get cells was markedly increased in teh Na-Sal group（0.24）vs the control（0.03）.CONCLUSION Na-Sal is most po-tent in inhibiting growth and inducing apoptosis in HL-60cells.
0 引言
非甾体类抗炎剂（NSAID）可抑制结肠癌、肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤细胞的生长［1］ .水杨酸钠（sodium salycilate，Na-Sal）对某些髓系白血病细胞株具有较强的促凋亡活性［2］ .为了深化对Na-Sal这一新药理作用的理解，我们采用HL-60细胞为对象，进一步探讨了Na-Sal对人早幼粒细胞白血病细胞生长与凋亡的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 Na-Sal，噻唑蓝（MTT）分别为Acros及Sigma公司产品，Annexin V FITC Kit购自美国Im-munotech公司，该试剂盒由异硫氰酸荧光素（FITC）标记的Annexin V，碘化丙啶（Propidium，PI）等组成，2～8℃避光保存.其他常用试剂为国产分析纯.人早幼粒细胞白血病HL-60细胞株由本校病理学教研室惠赠，悬浮培养于含100mL L-1 胎牛血清（杭州四季青）的RPMI1640（Gibco）培养液（含1×105 U L-1 青霉素和100mg L-1 链霉素）中，37℃，50mL L-1 CO2 条件下培养传代，实验用对数生长期细胞.
1.2 方法
1.2.1 细胞毒试验 HL-60细胞悬液100μL（1×104 ）接种于96孔板，孵育过夜，次日加入含不同浓度Na-Sal的RPMI1640100μL，使Na-Sal终浓度分别为0.5，1，3，5，7mmol L-1 ，每组3个平行孔;孵育24h后各孔加MTT（5g L-1 ）20μL，继续孵育4h，离心弃上清，加入150μL DMSO，平板振荡仪振荡10min，在酶联免疫检测仪测定A570nm 值，计算细胞存活率（处理组A570nm /对照组A570nm ）.实验重复3次.绘制剂量效应曲线，并求出HL-60细胞对Na-Sal的IC50 值，以此浓度的Na-Sal，再按上方法分别测定孵育12，24，36，48h时间点的细胞存活率，并绘制时间效应曲线.
1.2.2 透射电镜观察 HL-60细胞与5mmol L-1 Na-Sal孵育16h后，于倒置显微镜下观察悬浮状态下细胞的形态改变.然后将该细胞（1×106 L-1 ～1×107 L-1 ）离心5min（800r min-1 ），弃上清，沿管壁缓慢加入40mL L-1 戊二醛，4℃固定24h，常规电镜脱水、包埋，双铅染色，超薄切片，透射电镜（JEM-2000EX日本）观测靶细胞超微结构特征.
1.2.3 流式细胞仪术［3］ HL-60细胞和5mmol L-1 Na-Sal共孵育10h后取1×106 细胞，离心5min（1000r min-1 ），PBS洗2次，700mL L-1 冷乙醇4℃固定24h，与含10mL L-1 RNase的Tris-HCl缓冲液（pH7.4）孵育30min，PI染色30min，流式细胞仪（ProfileⅡCoulter USA）检测DNA含量.Annexin V结合分析按试剂盒说明书进行操作.流式细胞仪检测荧光强度. 2 结果
2.1 Na┐Sal抑制HL┐60细胞生长 Na-Sal对HL-60细胞生长有抑制作用，且这种作用呈时间、剂量依赖性.Na-Sal浓度增加，作用时间延长，细胞存活率降低.IC50 为5mmol L-1 （Fig1）.
图1 略
2.2 Na┐Sal对HL┐60细胞形态的影响 5mmol L-1 Na-Sal处理16h后多数HL-60细胞解离成彼此粘附成簇、且呈台盼蓝拒染的圆形小体.透射电镜下可见细胞固缩，染色质浓缩、边集至核膜下.
图2 略
2.3 Na┐Sal诱导HL┐60细胞形成亚二倍体峰 HL-60细胞与5mmol L-1 Na-Sal共同孵育10h后，流式细胞仪检测出现DNA含量为亚二倍体的细胞群，这群细胞的比例为0.22.Annexin V结合分析表明，HL-60细胞与5mmol L-1 Na-Sal共同孵育10h后，靶细胞的磷脂酰丝氨酸（PS）由细胞膜内转移到膜外，即出现PS外化.Na-Sal组的PS外化率明显高于阴性对照组（0.24vs0.03，Fig3）.
3 讨论
Na-Sal对HL-60细胞的生长具有明显的抑制作用.经5mmol L-1 （IC50 ）Na-Sal处理后，HL-60细胞出现以下特征:①多数HL-60细胞解离成彼此粘附成簇、且呈台盼蓝拒染的圆形小体，Kerr等称之为凋亡小体.透射电镜下可见细胞固缩，染色质浓缩、边集至核膜下，这些都是凋亡细胞的特征性改变.②流式细胞仪检测提示，部分靶细胞发生凋亡，DNA出现有控降解，并有部分DNA碎片透过胞膜漏至细胞外.③PS外化，这是细胞凋亡的早期生化事件之一.这些结果表明Na-Sal抑制HL-60细胞的生长的机制是诱导细胞凋亡.
图3 略
Na-Sal作为一种经典的NSAID，对环氧合酶（cyclooxygenase）的抑制作用弱，因此抑制前列腺素的合成在Na-Sal诱导凋亡的过程中可能没有重要作用.再则，HL-60细胞缺乏功能性p53蛋白，故Na-Sal触发的HL-60细胞凋亡也不依赖p53通路.鉴于Na-Sal诱导TF-1，CMK-1，U973，Mo7e等髓系白血病细胞株凋亡常伴有Mcl-1蛋白表达受抑，且并不影响Bcl-2，Bcl-Xl，Bax等凋亡相关蛋白的表达［2］ ，故抗凋亡蛋白Mcl-1（Bcl-2家族中的一个成员）的表达下调可能与Na-Sal触发的细胞凋亡有关.新近发现，Na-Sal除能下调抗凋亡蛋白Mcl-1外，尚能激活Cas-pase-3（cpp32），且该作用能被caspase-3特异抑制剂Z-VAD所阻断，表明Na-Sal触发的细胞凋亡依赖caspase-3的活化.鉴于HL-60细胞与上述白血病细胞系具有不同的生物学本质，故Na-Sal诱导HL-60细胞凋亡是否也通过类似机制需进一步研究［2，4］ .
参考文献
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