关于β射线诱导人肝癌细胞凋亡

【关键词】 188，Re
　　关键词:188 Re;凋亡;β射线;肝癌细胞
　　0 引言
　　凋亡或细胞程序性死亡是一种不同于细胞坏死的死亡方式，是在基因控制下的有序死亡，是一个主动性自杀过程，常伴有特征性形态学和生化变化.临床上放射线治疗肿瘤主要应用射线诱导细胞凋亡这一机制.188 Re发射2110KeV的β射线，155KeVγ射线，半衰期17h，具有良好的核物理性质.国外188 Re的研究主要在188 Re标记单克隆抗体对肿瘤的放射免疫治疗，并显示具有一定的疗效，而国内关于188 Re的研究较少，经文献检索未见有关于188 Re诱导细胞凋亡的报道.本实验旨在研究188 Re-β射线诱导人肝癌细胞系hHCC（human hepatoma carcinoma cell，人原发性肝癌细胞）凋亡的形态学变化、细胞周期，以探讨其发生机制.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 吖啶噔染料（AO染料），美国Amersco公司.188 Re可由188 W-188 Re发生器淋洗得到，188W-188 Re发生器购自上海科兴药业公司.日本Olympus BX60荧光显微镜.美国库尔特公司ELITE ESP型流式细胞仪.日本JEM-2000EX电子显微镜.
　　1.2 方法
　　
　　1.2.1 细胞培养方法 hHCC（中科院上海细胞所细胞库）培养于含100mL・L-1 小牛血清的RPMI1640培养瓶中，培育箱37℃，含50mL・L-1 CO2 .
　　1.2.2 吖啶噔染色标本的制备 10mg吖啶噔加入100mL PBS，溶解、过滤、4℃避光保存.用6孔板接种hHCC，每孔1×105 ;在另一板上设阴性对照，即只加细胞不加放射性核素188 Re，分箱培养.以7.4，11.1，14.8，18.5和22.2MBq188 Re分别加入hHCC培养孔中，培养72h，将细胞消化吹下，制备成细胞悬液，取95μL细胞悬液，加入5μL吖啶噔储存液，混匀，吸一滴混合液滴在载玻片上，加上盖玻片，荧光显微镜下观察、照相.
　　
　　1.2.3 透射电镜标本的制作 hHCC1×105 接种于培养瓶中，培养24h，换液，加入188 Re11.1MBq，继续培养72h.弃培养液，将细胞消化下来，以1000r・min-1 离心8min，弃上清，加入30mL・L-1 戊二醛固定，然后加入10mg・L-1 锇酸固定，再经程序脱水、渗透、环氧树脂包埋、超薄切片、铅铀染色，透射电镜下观察.
　　
　　1.2.4 流式细胞仪标本的制作 hHCC以1×105 接种于培养瓶中，培养24h，换培养液，分别加入3.7，7.4，11.1，14.8，18.5和22.2MBq188 Re，培养72h，另设阴性对照细胞，分箱培养.将细胞消化下来，PBS洗2遍，调整成1×109 ・L-1 单细胞悬液，取1mL细胞再加2mL4℃无水乙醇，吹散混匀，封口膜4℃保存24h以上.上流式细胞仪前，用PBS再洗一次，加碘化丙锭染色，测定DNA含量变化，分析细胞凋亡和细胞周期情况.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 荧光显微镜形态观察 hHCC经不同剂量188 Re照射后，细胞出现凋亡、死亡现象.正常细胞的细胞核DNA呈黄绿色均匀荧光，细胞质为橘黄色荧光，凋亡细胞的胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色荧光，甚至有黄绿色凋亡小体，坏死细胞的细胞质内黄绿色荧光均减弱甚至消失.阴性对照的细胞核形态完整、清晰，呈均匀的黄绿色荧光，胞核中有空泡，细胞质为橘黄色，形态完整.7.4MBq剂量细胞大致完整，胞核清楚，胞膜清晰无破裂，坏死细胞少见，细胞内荧光基本如对照组，染色均匀，凋亡细胞少见，11.1，14.8MBq剂量组黄绿色深染的凋亡细胞较多，如图1示其胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色荧光颗粒，甚至可见整个细胞固缩，明显的黄绿色致密浓染的荧光，分不清胞核与胞质，另见与胞体脱离的黄绿色浓染的数个凋亡小体呈圆形，细胞膜有伪足样突起.18.5，22.2MBq细胞大多死亡，死亡细胞黄绿色荧光减弱，染色浅淡，坏死细胞大多破裂，胞质流失，细胞形态不规则（图2）.
　　2.2 电镜观察 凋亡肝癌细胞微绒毛脱失，染色质固缩并凝结成块边集，细胞浆浓缩，内质网疏松与胞膜融合，形成一个个空泡.线粒体缩小，结构无明显变化（图3）.
　　
　　图1 － 图3 略
　　
　　2.3 流式细胞仪分析 凋亡细胞一个标志是，在正常细胞G1 峰前面出现一个DNA含量减少的“G1 亚峰”，用流式细胞仪分析阴性对照，3.7，7.4，11.1，14.8，18.5和22.2MBq细胞周期结果（图4）. 转贴于 　图4 略　　
　　3 讨论
　
　　辐射是诱导凋亡的重要途径，在临床上具有重要的应用价值，国外关于188 Re的放射免疫治疗方面的文章大部分是药代动力学及体内分布方面的研究，国内关于医学188 Re的研究，大部分是关于188 Re对一些疾病如滑膜炎、肿瘤骨转移疼痛等方面的治疗和188 Re标记的方法研究，查文献国内外均未见188 Re诱导凋亡方面的文章，因此188 Re诱导肝癌细胞凋亡这一研究是比较新颖的.
　　荧光显微镜观察表明在阴性对照和7.4MBq剂量组，细胞基本正常，胞核完整，黄绿色荧光染色均匀，细胞质为橘黄色，胞膜无破裂，凋亡少，死亡细胞少，说明剂量低时不足以诱导细胞大量凋亡，在11.1，14.8MBq剂量组凋亡细胞出现最多，在18.5，22.2MBq时可见细胞呈雪花状大片坏死，这说明大剂量照射后细胞凋亡和其他形式的细胞死亡是造成细胞减少的共同原因，也说明合适的照射剂量可诱导细胞凋亡而不致其死亡，表明188 Re诱导肝癌细胞凋亡具有一定的剂量依赖性，这对临床放射线治疗肿瘤有重大意义.
　　流式细胞仪检测再次表明188 Re诱导肝癌细胞凋亡非常明显，从流式细胞仪图中看出随着剂量增加，G1 峰逐渐下降，G1 峰前出现凋亡峰 G1 亚峰，其随剂量增加，峰值越来越高，说明凋亡量逐渐增加，所占细胞比重越来越高.流式细胞仪分析显示暂时诱导细胞阻止在G0 /G1 期，促进了凋亡发生，在18.5，22.2MBq可见G1 亚峰左移，细胞大量死亡.M峰值下降，说明细胞活力下降，增殖能力下降.
　　
　　188 Re是一种新型治疗核素，能明显诱导肝癌细胞凋亡，在内照射治疗肿瘤方面临床上具有重要意义.本研究通过离体实验，确定188 Re-β射线诱导肝癌细胞的合适剂量，为进一步摸索188 Re治疗肝癌提供参考.
　　参考文献:
　　
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