作者：贾明峰，侯相麟，赵丽，刘蓓，李娟，陈轩
【关键词】 骨髓细胞
【Abstract】 AIM: To investigate the effects of adult bone marrow mesenchymal stem cells on the expansion of umbilical cord blood CD34+ cells ex vivo. METHODS: Adult bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured as feeder layer. Umbilical cord blood CD34+ cells were cultured in combination with mesenchymal stem cells， stem cell factor， Interleukin11 and granulocytemacrophage colony stimulating factor， respectively. At the end of 3 weeks， the total number of nucleated cells ， colony forming cells and CD34+ cells was repeatedly counted in culture system for 3 weeks to obtain the fold of expansion. RESULTS: The mesenchymal stem cells and cytokines coculture systems significantly enhanced the expansion of the cord blood cells with the increase of the total number of nucleated cells by 114.2±2.4fold， colony forming cells by 40.5±8.6fold and CD34+ cells by 11.3±0.4fold， respectively. CONCLUSION: The expansion of umbilical cord blood CD34+ cells can be enhanced ex vivo by adult bone marrow mesenchymal stem cells combined with cytokines.
【Keywords】 ex vivo amplification; CD34+ cell; cord blood; bone cells; stem cells
【摘要】 目的： 探讨骨髓间充质干细胞(MSCS)对脐血CD34+细胞体外扩增作用. 方法： 分离培养成人MSCS作为滋养层，联合SCF， IL11和GMCSF分别组成对脐血CD34+细胞的不同扩增体系，培养3 wk后观察脐血有核细胞、CFCs以及CD34+细胞扩增倍数的变化. 结果： MSCS联合细胞因子组较其他组培养体系对有核细胞总数、CFCs含量及CD34+细胞含量均具有明显的扩增作用，分别扩增了114.2±2.4， 40.5±8.6， 11.3±0.4 倍. 结论： 成人MSCS协同其他细胞因子可增强脐血CD34+细胞的体外扩增作用.
【关键词】 体外扩增；CD34+细胞；脐血；骨髓细胞；干细胞
0引言
骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSCs）作为骨髓造血微环境中的一种重要细胞成分，近年来成为干细胞研究领域的一大热点. MSCs具有自我更新和多向分化潜能，在体外可被诱导分化为多种结缔组织及部分来源于外胚层的组织，形成骨、软骨、骨骼肌、腱、韧带、真皮、脂肪、骨髓基质和神经［1，2］. 此外，还分泌多种生长因子支持骨髓造血，藉此MSCs可在体外作为滋养细胞层进行造血干/祖细胞扩增. 自脐血（umbilical cord blood，UCB）中发现造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)以来，脐血HSC移植用于治疗恶性及非恶性血液病日益广泛，但单份脐血所含的造血细胞不足以满足成人的移植所需，大量扩增后才能用于移植. 鉴于此，我们探讨了来自成人的MSCS对脐血CD34+ 细胞的体外扩增作用.
1材料和方法
1.1材料
正常成年男性献骨髓者2例，健康足月分娩儿脐血14例，取自兰州市慈和堂医院和本院妇产科. Percoll分离液（密度1.073 kg/L)，淋巴细胞分离液（密度1.077 kg/L），马血清（HS）均购自TBD 公司；DMEMLG培养基购自PAA Lab (Germany)；IMDM购自Gibco公司;胎牛血清(FBS)为杭州四季青公司产品;BSA、甲基纤维素、β巯基乙醇及L谷氨酰胺购自Sigma公司；重组人干细胞因子（rhSCF），重组人白细胞介素11（rhIL11）， 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF），重组人粒细胞集落刺激因子（rhGCSF），重组人红细胞生成素（rhEPO）均购自Peprotech公司；荧光标记的抗CD34单克隆抗体（CD34PE）购自Coulter Immunotech公司；抗CD29， CD44， CD45和抗HLADR单克隆抗体购自PharMingen公司.
1.2方法
1.2.1MSCs的分离纯化及培养MSCs的分离纯化及培养按文献［3］介绍的方法进行. 收集正常肝素抗凝骨髓约10 mL，用Percoll溶液梯度离心，900 g 30 min，收集中间相为有核细胞，然后将细胞按2×108 /L密度接种于DMEMLG培养基 (含100 mL/L FBS， L谷氨酰胺，青霉素105 u/L，庆大霉素8×104 u/L)的塑料培养瓶中，37℃， 50 mL/L CO2饱和湿度孵箱中培养，72h后更换培养基，以后每3~4 d换液一次. 当贴壁细胞达90%以上融合时，用2.5 g/L胰酶0.2 g/L EDTA消化后传代培养. 传代第3代以后用于以下实验.
1.2.2MSCs表面分子测定用2.5 g/L胰酶0.2 g/L EDTA消化收获细胞，至少2×105个细胞与抗CD29， CD44， CD45， HLADR抗体室温反应30 min， PBS洗涤2次，后与FITC标记的二抗避光反应15 min. 细胞洗涤后悬浮于PBS中，Coulter Epics XL流式细胞仪分析相关数据.
1.2.3脐血的采集、单个核细胞分离及CD34+细胞含量测定收集正常足月新生儿脐血，4℃保存运输，于4 h内用淋巴细胞分离液分离单个核细胞（mononuclear cells， MNC）. 取100 μL MNC悬液上机检测CD34+细胞含量，具体方法是： 取阴性对照（Mouse IgG1）与荧光标记的CD34单抗（CD34PE）各20 μL于试管底部，再分别加入100 μL细胞悬液室温避光孵育15 min，后用QPrep(全血细胞制备仪)处理细胞，于测试管内加100 μL Flow Count（荧光微球），混匀后用流式细胞仪分析.
1.2.4细胞扩增分组和脐血MNC， CD34+细胞体外培养根据培养体系中有否滋养层及是否添加细胞因子组合分为以下3组： A组为无滋养层加细胞因子，即MNC+SCF+IL11+GMCSF；B组为骨髓间充质干细胞滋养层无细胞因子，即MNC+MSC；C组为骨髓间充质干细胞滋养层加细胞因子，即MNC+MSC+SCF+IL11+GMCSF. 脐血MNC， CD34+细胞培养在24孔培养板中进行，培养体系为： IMDM中含125 mL/L FBS， 125 mL/L马血清，各种人细胞生长因子（SCF 50 μg/L， IL11 50 μg/L， GMCSF 2 μg/L）. 脐血MNC， CD34+细胞与MSC 共培养体系为： MNC按1.0×1011/L 接种于铺满MSCs滋养层的24孔板中，每孔1 mL， 33℃， 50 mL/L CO2和饱和湿度的培养箱中连续培养3 wk. 每周半量换液，并计数有核细胞（nucleated cells， NC）总数、作集落培养及扩增细胞中CD34+细胞含量测定.
1.2.5造血祖细胞集落培养用甲基纤维素半固体集落培养法测定扩增细胞集落形成能力，培养体系为： IMDM中含300 mL/L HS， 10 g/L BSA， 2 mmol/L L谷氨酰胺，1×10-4 mol/L β巯基乙醇（2MP）， rhSCF 50 μg/L， IL11 50 μg/L， GMCSF 20 μg/L， G CSF 20 μg/L， EPO 3000 u/L和9 g/L甲基纤维素. 培养在24孔培养板中进行，37℃， 50 mL/L CO2和饱和湿度条件下连续培养14 d. 每周在倒置显微镜下直接计数集落形成细胞（colonyforming cells， CFCs），≥40个细胞为1个集落.
统计学处理: 数据用x±s表示，采用SPSS8.0统计软件作重复测量资料的方差分析，P&<0.05认为有统计学意义.
2结果
2.1MSC的形态学特征及表面抗原特性经Percoll分离液分离后培养的骨髓单个核细胞，大部分于24 h内即贴壁，倒置显微镜下，细胞呈圆形有小的胞质突起. 72 h后，大多数细胞有胞质突起. 1 wk后以梭形细胞为主，胞质丰富，核大，核染色质细，核仁明显. 以后随传代次数的增加，细胞扩增显著，呈成纤维细胞样形态，平行排列生长或似漩涡状. 流式细胞仪测定F3代MSC 表面分子显示，CD34， CD45， HLADR等为阴性，CD29， CD44等为阳性，并且传代前后MSC形态及表面标志一致.
2.3MSC对脐血NC总数、CFCs的扩增作用不同的扩增体系在体外连续观察3 wk，结果显示：A组到C组NC 总数均得到不同程度的扩增（Tab 1），其中C组扩增最为明显，与最初所接种细胞相比，于培养第1， 2和3周分别扩增7.6±1.1， 41.5±1.3， 114.2±2.4倍，并且与A组和B组分别比较，有显著的统计学意义（P&<0.05）. 脐血中的CD34+细胞多为较早期的造血干/祖细胞，故CFC的含量较低. 在2 wk的体外培养过程中，各组CFC产率不尽相同（P&<0.05），并且它们的扩增倍数在第2周达到较高值（Tab 1），其中C组扩增倍数达40.5±8.6. 表13组扩增体系对脐血NC， CFCs扩增倍数（略）
2.4MSC对脐血CD34+细胞的扩增作用于培养的第1， 2和3周分别取脐血MNC，用PECD34单克隆抗体标记，流式细胞术荧光微球标记法检测其中CD34+细胞的含量. 结果表明，不同组别CD34+细胞总数均得到不同程度扩增，而C组的扩增效果明显优于其他两组（P&<0.05），CD34+细胞于第2周和第3周分别扩增（11.3±0.4）倍和（6.1±1.1）倍（Fig 1）.
3讨论
目前认为MSC是基质细胞的前体细胞，参与构成骨髓造血微环境，其调节造血的机制是通过MSC与造血干细胞的密切接触以及各类造血生长因子的作用完成的. Majumdar等［4］检测人MSC的基因表达及不同诱导条件下MSC细胞因子的表达水平变化及其对HSC的支持作用发现，MSC 表达IL11， LIF， MCSF及SCF的mRNA. 这些细胞因子都是很重要的造血生长因子，它们是MSC参与造血调控、支持造血的物质基础. 近年来脐带血HSC移植的例数在逐年增加，但由于单份脐血所含造血细胞数量少，不能满足成人患者移植的需要，故许多研究者尝试通过各种体外扩增的方法提高脐血移植的细胞数. 本研究基于MSC体外支持长期造血的特性，外加细胞因子观察了其对脐血CD34+细胞的体外扩增作用. MSC经分离、培养和纯化三代后用作饲养层，根据是否加用SCF， IL11和GMCSF分为三组不同扩增体系培养3 wk，结果各组对NC， CFCs和CD34+细胞均有不同程度的扩增. MSC加细胞因子组较MSC 组和单纯细胞因子组的造血细胞总数和CFC明显增多，有核细胞总数扩增倍数最高可达(114.2 ±2.4)倍，CFC扩增倍数第2周达(40.5±8.6)倍. 在对CD34+细胞扩增的动态观察中采用流式细胞仪CD34+细胞绝对定量法，较为精确地测定了脐血有核细胞中CD34+细胞含量在扩增前后的变化，各组CD34+细胞总数在第2周均达最高，其中以MSC加细胞因子组对CD34+细胞扩增作用最强，CD34+细胞总数在第2周扩增(11.3±0.4)倍，明显高于其他两组（Fig 1）. 脐血CD34+细胞于第2周后含量下降，可能是向定向祖细胞发生了分化，但其绝对计数仍显著高于分离培养前. MSC体外扩增脐血造血干细胞关键是要建立好滋养层. 实验中发现，MSC最初1 wk内生长缓慢，需10 d左右达90%以上融合，此时传代后细胞生长迅速，5 d后即达80%以上融合，到第3代以后MSC生长渐趋稳定，流式细胞仪检测显示不表达造血细胞的标志，故本实验选用了第3代以后的MSC.
随着基因工程的发展，各种重组造血生长因子广泛用于脐血造血干/祖细胞的体外扩增. SCF是原癌基因ckit的配体，是一种作用于最早期造血干/祖细胞的造血生长因子，在维持造血细胞存活，促进造血细胞增殖分化，调控各系造血细胞的生长发育中起重要作用. SCF单独作用刺激造血细胞增殖和促进克隆形成的能力都很微弱，而与其他细胞因子有明显协同促进造血功能等作用. IL11能与多种其他细胞因子协同支持造血细胞前体细胞长期生长，对淋巴系、髓系、红细胞系和巨核细胞系都具有促进生长作用，尤其对巨核细胞系作用明显，能显著增加血小板的数量［5］. GMCSF对粒细胞系和单核细胞系细胞均有促进生长、诱导分化的功能，并维持造血前体细胞和成熟细胞的存活. 以上三种细胞因子加上MSC滋养层构成了脐血CD34+细胞扩增的强大物质基础，使脐血CD34+细胞得到有效扩增.
我们选用流式细胞仪荧光微球标记法测定脐血MNC中CD34+细胞的含量，较以往测定CD34+细胞的百分率更简便、精确，值得在临床造血干细胞移植中推广使用. 尽管脐带血干细胞移植已有十几年的历史，研究者在脐血干细胞扩增方面做了大量的实验研究，但目前很少见到利用扩增的脐血造血干细胞临床移植成功的报道，这一课题仍需要作进一步的探讨.
【
参考文献
】［1］ Deng W， Obrocka M， Fischer I， et al. In vitro differentiation of human marrow stromal cells into early progenitors of neural cells by conditions that increase intracellular cyclic AMP ［J］. J Biochem Biophys Res Commun， 2001;282:148-152.
［2］ Mingull JJ， Conget P， Erices A. Biology and clinical utilization of mesenchymal progenitor cells ［J］. Braz J Med Res， 2003;33：881-887.
［3］ Majumdar MK， Thiede MA， Mosca JD， et al. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrowderived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells ［J］. J Cell Physiol， 1998;176:57-66.
［4］ Majumdar MK， Thiede MA， Haynesworth SE， et al. Human marrowderived mesenchymal stem cells（MSCs）express hematopoietic cytokines and support longterm hematopoiesis when differentiated toward stromal and osteogenic lineages ［J］. Hematother Stem Cell Res， 2000;9：841.
［5］ Lazzari L， Lucchi S， Rebulla P， et al. Long term expansion and maintenance of cord blood haematopoietic stem cells using thrombopoietin， Flt3lignd， interleukin6 and IL11 in a serum free and stroma free culture system ［J］. Br J Haematol， 2001;112:397-404.