作者：李习玲 连小华 张诚 杨恬
【关键词】 角质形成细胞
【Abstract】 AIM: To explore the expression of annexinⅡ in differentiation of human epidermal keratinocytes. METHODS: ① Normal human epidermal keratinocytes（NHEK）were cultured in serum and Ca2+ free keratinocyte growth medium (KGM). The proliferation and differentiation of keratinocytes was regulated by changing Ca2+ concentration in medium and the expression of annexinⅡ was detected by immunocytochemistry (ICC). ② Immunohistochemistry was used to detect annexinⅡexpression in noenatal and adult epidermis. RESULTS: ①When Ca2+ concentration in medium was 0.07 mmol/L， annexinⅡ was expressed weakly and was located perinuclearly. When the calcium concentration was elevated to 1.5 mmol/L， the expression of annexinⅡ was still slight， but with a dramatic redistribution to the cellcell borders within 24 h after the calcium elevation. Within 48 h after the calcium elevation， annexinⅡ was seen both in cytoplasm and cell membrane and had a much strong expression. ② In sections of human normal skin， annexinⅡ was mainly localized in the superficial and more differentiated layers of the epidermis. CONCLUSION: AnnexinⅡ may be involved in regulating the differentiation of NHEK.
【Keywords】 annexinⅡ expression; epidermis; keratinocyte; cell differentiation
【摘要】 目的: 探讨annexinⅡ在正常人表皮角质形成细胞（normal human epidermal keratinocytes， NHEK）分化中的表达. 方法: ①体外培养NHEK，采用无血清无钙离子的角质形成细胞生长培养基（KGM），通过改变培养基中的钙离子浓度来调节NHEK的增殖和分化，采用免疫细胞化学(ICC)技术分别检测annexinⅡ在增殖和分化NHEK中的表达. ② 采用免疫组织化学（IHC）技术检测成人及新生儿表皮NHEK中annexinⅡ蛋白的表达. 结果: ①低钙（0.07 mmol/L）培养条件下，annexinⅡ呈弱阳性表达，且主要分布于核周. 高钙（1.5 mmol/L）条件下培养24 h后，annexinⅡ仍呈弱阳性表达，但表达的部位出现明显变化，主要分布于细胞间；48 h后，annexinⅡ于胞质及胞膜均呈强阳性表达. ② 人正常皮肤切片的IHC结果显示：annexinⅡ主要分布于基底上层的分化NHEK中. 结论: annexinⅡ可能参与人表皮NHEK分化的调控.
【关键词】 annexinⅡ表达；表皮；角质形成细胞；细胞分化
0引言
annexinⅡ是新近发现的纤维蛋白溶解酶原(PLG)和组织型纤溶酶原激活物(tPA)的共受体，是Ca2+介导的具有高亲和力的磷脂结合蛋白，具有多种重要生理功能，如参与纤溶、细胞骨架活动、胞膜运输、细胞间的黏附，粘合素介导的细胞信号转导、病毒感染及细胞的增殖、迁移与分化等［1-4］. 本室实验结果显示，tPA与正常人表皮角质形成细胞（normal human epidermal keratinocytes， NHEK）的分化密切相关［5］，为进一步了解其受体annexinⅡ在NHEK分化中的作用，我们一方面通过建立NHEK增殖和分化的体外培养模型，采用免疫细胞化学(ICC)技术分别检测annexinⅡ在增殖和分化NHEK中的表达；另一方面，选用成人及新生儿的皮肤作为研究对象，采用免疫组织化学（IHC）技术检测annexinⅡ蛋白的表达，以探讨annexinⅡ在人表皮NHEK分化中的作用.
1材料和方法
1.1材料细胞培养及组织切片的标本，均来自手术环切的成人及新生儿阴茎包皮.
1.2方法
1.2.1细胞培养将包皮用无菌生理盐水（含青链霉素50×104 u/L）清洗干净后，0.5 mL/L醋酸洗必泰溶液浸泡10 min，去除皮下脂肪，将皮肤剪成0.5 cm×1.0 cm小块，DHanks液（含青链霉素50×104 u/L）清洗3遍，置于2.5 g/L DispaseⅡ（Sigma）中，于4℃消化6 h，分离表皮和真皮，将分离所得的表皮置于2.5 g/L胰酶（Hyclone）中，于室温消化3 min，加入含150 mL/L胎牛血清（Hyclone）的DHanks液终止消化，吹打制备细胞悬液，1000 r离心10 min，弃上清，加入含0.07 mmol/L Ca2+的KGM(CC3158，Clonetics)，混匀后按1×109/L接种，于37℃含50 mL/L CO2湿度为950 mL/L的培养箱进行培养. 当细胞长至70%~80%融合时，即可转至含1.5 mmol/L Ca2+的KGM［5，6］.
1.2.2免疫细胞化学（ICC）方法抗K10 mAb(美国Neomarkers公司); 抗annexinⅡ mAb(American Diagnostic公司); SP试剂盒(北京中山公司产品). 具体步骤为：丙酮固定10 min，PBS洗3×3 min. 3 mL/L h3O2甲醇封闭15 min以阻断内源性过氧化物酶，PBS洗3×3 min. 正常羊血清封闭非特异性抗原15 min后，倾去血清，滴加一抗（K10为1∶100稀释，annexinⅡ为1∶500稀释），4℃放置过夜. PBS洗3×3 min，滴加生物素化二抗，37℃放置30 min. PBS洗3×3 min，滴加SP，37℃放置30 min. PBS洗3×3 min，AEC显色，水性封片剂封片，60℃烘烤30 min. K10用DAB显色. 以10 mmol/L PBS替代一抗作为阴性对照，苏木精复染.
1.2.3免疫组化（IHC）方法抗annexinⅡ mAb(American Diagnostic公司); SP试剂盒(北京中山公司). 具体步骤为：皮肤标本在40 g/L多聚甲醛中固定24 h后浸入300 g/L蔗糖脱水24 h，低温恒冷切片机切成6 μm厚切片，风干后丙酮固定10 min，PBS洗3×3 min. 10 mL/L h3O2甲醇封闭15 min以阻断内源性过氧化物酶，PBS洗3×3 min. 正常羊血清封闭非特异性抗原15 min后，倾去血清，滴加1∶500稀释的一抗，4℃放置过夜. PBS洗3×3 min，滴加生物素化二抗，37℃放置30 min. PBS洗3×3 min，滴加SP，37℃放置30 min. PBS洗3×3 min，DAB显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明. 以10 mmol/L PBS替代一抗作为阴性对照.
2结果
培养细胞的结果显示，低钙（0.07 mmol/L）条件下，培养的NHEK处于增殖状态，单层生长，细胞形态多角形呈铺路石样，细胞间的间隙清楚，分化标记物K10染色为阴性，annexinⅡ呈弱阳性表达，且主要分布于核周（Fig 1）. 将培养基的钙离子浓度改变为1.5 mmol/L时，培养的NHEK于3~4 h后即出现变化，细胞间的间隙消失并逐渐出现分层. 培养24 h后，annexinⅡ仍呈弱阳性表达，但表达的部位出现明显变化，主要分布于细胞间及细胞膜上（Fig 2），未检测到K10的表达；培养48 h后，annexinⅡ于胞质及胞膜均呈强阳性表达（Fig 3），K10亦呈阳性表达. 成人（Fig 4A）及新生儿（Fig 4B）皮肤切片的IHC结果显示：annexinⅡ在表皮基底上层的分化NHEK中呈强烈的高表达，且主要分布于细胞膜. ICC和IHC的阴性对照分别为Fig 5， 6.
3讨论
AnnexinⅡ是Ca2+介导的具有高亲和力的磷脂结合蛋白，具有多种重要生理功能，如参与纤溶、细胞骨
架活动、胞膜运输、细胞间的黏附，粘合素介导的细胞信号转导、病毒感染及细胞的增殖、迁移与分化等［1-4］. Vellucci等［7］采用原代培养的人角质形成细胞（HKs）和表皮鳞癌细胞株（SqCCs），通过差减杂交实验发现，HKs内annexinⅡ的转录水平比SqCCs高2~20倍，并由此推断annexinⅡ与角质形成细胞的分化密切相关. 本研究显示，在用KGM培养NHEK时，低钙条件（0.07 mmol/L）下，NHEK处于增殖状态，annexinⅡ呈弱阳性表达，且主要分布于核周. 高钙条件（1.5 mmol/L）下，NHEK逐渐进入分化状态，培养24 h后，annexinⅡ仍呈弱阳性表达，但表达的部位出现明显变化，主要分布于细胞间；培养48 h后，annexinⅡ于胞质及胞膜均呈强阳性表达. 此外，成人及新生儿皮肤切片的IHC结果显示，annexinⅡ在表皮基底上层的分化NHEK中呈强烈的高表达，且主要分布于细胞膜. 这些结果均表明annexinⅡ与NHEK的分化相关.
然而，已有的研究发现，在表皮NHEK的增殖、分化、迁移功能活跃时，如胚胎期、创伤、病理条件（如银屑病、天疱疮、大疱性天疱疮等）下，均可检测到tPA的表达，但成人表皮NHEK内tPA的表达量极低，用常规技术方法难以检测［13-16］. 而annexinⅡ于成人及新生儿表皮基底上层的分化NHEK中却呈强烈的高表达. 此现象提示：annexinⅡ除在表皮NHEK增殖、分化、迁移功能活跃的“应激”条件下，作为tPA的受体，通过活化纤溶酶原为纤溶酶，降解胞外的基质来促进角质形成细胞的迁移和分层，而参与表皮NHEK的分化调控外［5，11］，可能在调节正常表皮NHEK的分化中起着更为重要的作用. 体外培养条件下，在用高钙诱导NHEK分化的初期，annexinⅡ出现由核周向细胞间移位的现象，此过程可能在annexinⅡ参与NHEK的分化调控中起重要作用.
致谢杨珂、余谨.
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