【Abstract】 AIM: To investigate the expression of PTEN protein in tissues of prostatic carcinoma (Pca) and its correlation with the apoptosis of cancer cells. METHODS: Expression of PTEN protein and apoptotic index (AI) were detected by SP immunohistochemical and terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP biotin nick end labeling (TUNEL) technique in 42 cases of Pca and 10 cases of normal prostate (NP). The relationship between the PTEN gene deletion and AI in Pca was analyzed. RESULTS: All of the ten cases of NP were positive for PTEN protein. The overall deletion rate of PTEN gene in Pca was 64.3% and it was strongly associated with the degree of differentiation， clinical stage and lymph metastasis in Pca (P&<0.05)， but it had no correlation with the age of patients. The PTEN gene deletion was negatively correlated with AI in Pca (r = -0.746， P&<0.001). CONCLUSION: There is a higher deletion rate of PTEN gene in Pca， which may play an important role in the genesis and development of some Pca and result in the reduction of cell apoptosis in Pca. Detection of PTEN protein and AI in Pca may be helpful to evaluate the degree of cell differentiation， decide on therapeutic strategies and deduce prognosis.
【Keywords】 PTEN protein; prostatic neoplasms; immunohistochemistry
【摘要】 目的： 探讨抑癌基因PTEN蛋白在前列腺癌(Pca)组织中的表达及其与肿瘤细胞凋亡的关系. 方法： 采用免疫组织化学SP法和DNA原位末端标记TUNEL法分别测定42例Pca及10例正常前列腺组织(NP)中PTEN蛋白的表达和肿瘤细胞凋亡，并分析PTEN基因表达缺失与肿瘤细胞凋亡的关系. 结果： NP组织中PTEN蛋白全部阳性表达；而Pca中PTEN基因表达缺失率达64.3%，且与肿瘤细胞分化程度、临床分期和有否淋巴结转移密切相关；PTEN基因表达缺失与肿瘤细胞凋亡成负相关(r=-0.746， P&<0.001). 结论： 前列腺癌组织中PTEN表达缺失率较高；PTEN基因失活在Pca的发生发展中起重要作用，且导致肿瘤细胞凋亡减少；联合检测PTEN蛋白和凋亡指数，有助于对肿瘤细胞的分化程度作出正确评价，以指导临床治疗及估计预后.
【关键词】 PTEN蛋白；前列腺肿瘤；免疫组织化学
0引言
前列腺癌(prostatic carcinoma， Pca)高发于老年男性，是最多见的恶性肿瘤之一. p21， p53及p16基因的异常表达与前列腺癌的发病密切相关［1，2］，表明Pca的发生是多基因调控的. PTEN(也称MMACI或TEPI)是1997年发现的一种抑癌基因， 通过使PIP3(3， 4， 5三磷酸脂酰肌醇)去磷酸化，从而抑制细胞增殖、促进其凋亡. Li等［3］应用RTPCRSSCP方法检测多种肿瘤细胞系和移植瘤中PTEN基因的突变率，发现多形性胶质母细胞瘤为31%，前列腺癌为100%，乳腺癌为6%，而原发性胶质母细胞瘤为17%. 研究表明PTEN基因突变在Pca的发生、发展和转移中起重要作用［4］. 为此，我们检测前列腺癌组织中PTEN蛋白的表达及肿瘤细胞的凋亡情况，探讨其临床意义.
1材料和方法
1.1材料
1990/2002我院42例开放性前列腺切除术的Pca石蜡包埋标本(年龄49～73岁，平均61岁)，和10例正常前列腺(NP)标本(为尸体解剖标本，年龄23~48岁，平均32岁)，均为40 g/L甲醛固定. 所有患者术前均未接受任何治疗. 以上标本全部经苏木精伊红(HE)染色，病理诊断明确. Pca参照Gleason的分级标准，按腺体分化程度将Pca分为： 高分化腺癌12例、中分化腺癌17例、低分化腺癌13例. 按WhitmoreJewett的临床分期标准分为: A期8例、B期15例、C期11例、D期8例. 有淋巴结转移16例. 石蜡标本4 μm厚连续切片，分别行复查诊断、PTEN蛋白免疫组化和细胞凋亡检测.
1.2方法
1.2.1免疫组化采用超高敏SP法一抗为鼠抗人PTEN mAb(1∶100)，二抗为羊抗鼠IgG，以上抗体及SP试剂盒均购自福州迈新公司. 石蜡切片脱蜡入水，30 mL/L h3O2阻断内源性过氧化物酶，高温高压修复抗原，小牛血清封闭10 min，加一抗后4℃过夜，生物素标记的二抗孵育10 min，链酶亲和素过氧化氢酶孵育10 min，DAB显色，苏木精复染，脱水封片. 以该公司提供的良性前列腺增生组织片作为阳性对照，以PBS液代替一抗作为阴性对照.
1.2.2细胞凋亡检测采用DNA原位末端标记(TUNEL法)TUNEL试剂盒为德国宝灵曼公司产品，检测程序参照试剂盒说明书，方法简略为： 常规脱蜡入水，20 mg/L蛋白酶K37℃消化15 min， 30 mL/L h3O2阻断内源性过氧化物酶10 min，1∶10小牛血清封闭非特异性反应，滴加末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)反应液，室温孵育60 min，DAB显色. 以乳腺癌标本作为阳性对照，以PBS液代替TdT反应液作为阴性对照.
1.2.3结果判断① 染色程度： 组织切片中胞质出现黄至棕黄色颗粒者为阳性细胞标志，将阳性细胞按其数量及显色程度分为3级： 表达弱阳性(＋)，即阳性细胞数＜10%、显色强度为淡黄色或个别细胞呈黄至棕黄色；表达强阳性()，即阳性细胞数＞60%、多数细胞呈黄至棕黄色. 表达中度阳性()，即阳性细胞数及显色强度介于弱阳性与强阳性之间. 凡显色强度与背景无明显差异者为阴性;② 凋亡细胞计数： 细胞核上有黄至棕色颗粒着色为阳性标志，光镜下随机观察5~10个视野，计数每高倍视野(×400)中平均阳性凋亡细胞数，其阳性细胞数的百分比为凋亡指数(apoptosis index， AI).
统计学处理： 计量资料结果以x±s表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验.
2结果
2.1PTEN蛋白在前列腺组织中的表达组织切片中胞质出现黄至棕黄色颗粒者为阳性细胞标志. NP组织中均有PTEN不同程度的表达（Fig 1）；而Pca中PTEN基因表达缺失率为64.3%，二者之间差异有极显著意义(P&<0.01). Pca组织中PTEN蛋白表达与不同临床病理特征关系见Tab 1： 肿瘤分级愈低、临床分期愈晚，PTEN基因表达缺失率愈高；有淋巴结转移者显著高于无淋巴结转移者；而与患者年龄无关.表1PTEN蛋白在前列腺组织中的表达及肿瘤细胞的凋亡（略） 2.2Pca中细胞凋亡情况凋亡细胞阳性定位于细胞核，在前列腺组织中散在分布(Fig 2). Pca细胞凋亡情况见Tab 1. Pca组AI明显高于NP组，二者之间差异有显著意义(P&<0.05)；低分化组AI显著低于中、高分化组(P&<0.01)；而中、高分化组间差异无显著意义(P&>0.05)；有淋巴结转移组明显低于无淋巴结组(P&<0.001).
2.3PTEN蛋白的表达与AI的相关性统计分析表明，Pca组织中PTEN基因表达缺失与AI呈负相关(r=-0.746， P&<0.001).
3讨论
3.1PTEN表达缺失与Pca的发生、发展PTEN是第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，定位于染色体10q23.3，其蛋白产物最显著的特点是具有磷酸酪氨酸酶和双重特异性磷酸酶结构域，且与张力蛋白和辅助蛋白具有同源性［3］. 目前普遍认为PTEN的抑癌机制由以下3个途径共同完成： ① 通过使PIP3(3，4，5三磷酸脂酰肌醇)去磷酸化，从而抑制细胞增殖、促进细胞凋亡［5］； ② 通过对FAK(聚集黏附激酶)的去磷酸化，从而抑制细胞转移、扩散［6］；③ 通过抑制MAPK细胞信号传导，使细胞生长、分化受抑制［7］. PTEN表达异常促进肿瘤细胞的生长、浸润和转移. 本研究结果显示： 42例Pca中，27例未观察到PTEN蛋白的表达，表达缺失率为64.3%，而10例正常前列腺组织均可观察到不同程度的PTEN蛋白表达；临床分期愈晚、组织分化程度愈低，PTEN蛋白的缺失率愈高，有淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组. McMenamin等［4］的研究表明， Pca患者预后愈差、恶性程度愈高，其PTEN蛋白水平愈低，可以认为PTEN表达缺失是Pca不良预后的病理标志. 提示Pca的发生、发展与PTEN基因表达产物缺失有关.
3.2PTEN表达缺失与肿瘤细胞凋亡的关系PTEN作为一种肿瘤抑制基因参与细胞凋亡调控，主要是依赖其脂质磷酸酶的活性而实现的. PIP3(3，4，5三磷酸脂酰肌醇)是PTEN脂质磷酸酶作用的底物，一般情况下，PIP3在细胞水平上很低，但一旦遇到生长因子的刺激， PIP3的水平会迅速上升. PIP3在细胞膜上的聚集也使丝氨酸/苏氨酸激酶Akt（也称PKB）被脱磷酸化而活化.活化的Akt通过2种方式起到抗细胞凋亡的作用，即阻止从线粒体释放细胞色素C和使Forkhead转录因子失活. Akt还会使凋亡因子BAD和caspase9脱磷酸化而失活. Stambolic等［8］在体外实验中发现，纯化的PTEN能从PIP3上转移特异的磷酸基团，使PIP2向PIP3的转化发生逆转，从而抑制了PIP3激酶的磷酸化作用，阻断了Akt及其下游激酶的活性，引起细胞凋亡. 而失去PTEN的作用会导致PIP3的聚集和Akt的高水平状态，从而导致细胞不受各种凋亡刺激的作用. 杨波等［9］将含PTEN的逆转录病毒载体载入前列腺癌细胞系PC3后，细胞生长明显受到抑制，细胞周期由G1S0期受抑制，并出现一个小的凋亡峰. 我们的研究发现，Pca组织中PTEN基因表达缺失率与AI呈负相关（r=-0.746， P&<0.001）. 表明PTEN基因失活抑制了Pca肿瘤细胞的凋亡.
【
参考文献
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Liu RF， Shao GX， Yang LJ， et al. The expression and correlation between gene p21 and gene p53 in human prostate carcinoma specimens ［J］. J Fourth Mil Med Univ， 1999;20(10):568-569.
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Liu RF， Shao GX， Wang H， et al. The relationship between the expression of tumor suppressor gene p16 and biological behaviors in prostate carcinoma ［J］. J Fourth Mil Med Univ， 1999;20(8):692-695.
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