作者：马佳佳，陈必良，马向东，王德堂
【关键词】 子宫内膜异位症
【Abstract】 AIM: To investigate the expression of phosphatase and tension homologue deleted on chromosome 10， the tumor suppressor gene PTEN， in ectopic endometrium in patients with endometriosis and to study the role of PTEN in the pathogenesis of the disease. METHODS: The expression of PTEN in ectopic endometrium in 37 patients with endometriosis， including 20 ovarian endometriosis and 17 adenomyosis patients， was analyzed by using in situ hybridization method. Thirtythrec patients with uterine myoma were taken as controls. RESULTS: The PTEN expression level in the ectopic endometrium decreased significantly as compared with that in the controls (48.6% vs 93.9%， P=0.0002)， and all the positive signals were mainly seen in the cytoplasm. The gene expression showed a cyclic change both in patients with endometriosis and in controls. The PTEN staining was found to be more frequent in secretory phase than in proliferative phase. But the difference was statistically significant only in the control group (P=0.0102). The PTEN positivity rate in the patients with adenomyosis was 55.0% and in those with ovarian endometriosis was 52.9%. No significant difference was found between the two groups (P=0.4018). The expression of PTEN mRNA was significantly correlated with the stage of the endometriosis (P=0.0026). CONCLUSION: The change of the PTEN expression may be involved in the pathophysiology of endometriosis.
【Keywords】 PTEN; endometriosis; endometrium;in situ hybridization; genes， suppressor， tumor; RNA， messenger
【摘要】 目的： 检测第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因（PTEN）在子宫内膜异位症（EMS）中的表达，探讨其在EMS发病机制中的作用. 方法： 收集EMS患者子宫内膜病灶37（卵巢巧克力囊肿20，子宫肌腺症17）例和正常子宫内膜33例，采用原位杂交技术检测PTEN mRNA在异位内膜组织中的定位和表达强度，并比较PTEN基因表达与EMS临床分型的关系. 结果： PTEN mRNA主要表达于腺体细胞的胞质中；与正常子宫内膜相比，PTEN基因在异位内膜组织中的表达显著降低(48.6% vs 93.9%， P=0.0002)；PTEN mRNA的表达呈明显的周期性改变，在增殖期内膜呈低水平表达，分泌期表达增加，但这一差异仅在正常子宫内膜组织中有意义(P=0.0102)；PTEN mRNA的表达水平随临床分期的增加而降低（P=0.0026）；但在子宫肌腺症和卵巢巧克力囊肿组织中，PTEN基因表达水平无差异(55.0% vs 52.9%， P=0.4018). 结论： PTEN mRNA表达水平的降低可能是EMS的发病机制之一.
【关键词】 PTEN；子宫内膜异位症；子宫内膜；原位杂交；基因，抑制，肿瘤；RNA，信使
0引言
子宫内膜异位症（endometriosis， EMS）是育龄期妇女常见的一种妇科病，近年国内报道的临床发病率约为10%，其发病机制涉及经血逆流、激素、免疫、遗传、环境等多个方面. 目前，在基因水平上研究EMS的发病机制及其生物学特性已经成为妇科基础研究的热点之一. 新近发现的第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因（phosphatase and tension homologue deleted on chromosome 10， PTEN），被认为是子宫内膜的看家基因［1］，在多种子宫内膜相关病变中PTEN基因表达的改变具有特殊意义，但国内外有关PTEN与EMS相关性的研究却较少. 我们采用原位杂交技术检测PTEN基因在EMS组织中的表达，并与正常子宫内膜进行比较，以探讨PTEN在EMS发病中的意义.
1对象和方法
1.1对象
① EMS组： 选取200306/200403间西京医院妇产科收治的EMS患者37（卵巢巧克力囊肿患者20，子宫肌腺症患者17）例. 年龄25～45(31±1.7)岁. 入院后均行卵巢巧克力囊肿剥除术或子宫切除术，术后经病理检查明确诊断. 37例样本中包括增殖期内膜18例，分泌期内膜19例. 按RAFS(1985)临床分期标准确定为I期8 例，Ⅱ期8例，Ⅲ期10例和Ⅳ期11例，异位病灶组织内均可见完整的腺体和间质;② 正常子宫内膜对照组： 选取同期因子宫肌瘤行全子宫切除术患者的子宫内膜33例，年龄27～44(32±1.3)岁，与EMS组年龄相比无统计学差异. 术中所取内膜组织均经病理检查证实为正常子宫内膜，其中增殖期内膜11例，分泌期内膜22例. 所有患者月经周期规律，无内分泌及其他特殊疾病史. 术前3 mo内未接受任何激素治疗. 子宫内膜分期按各期内膜形态学特点并结合患者月经史做出判断. PTEN原位杂交试剂盒、原位杂交专用盖玻片及DAB显色剂购自武汉博士德公司；DEPC为Sigma公司产品；PTEN寡核酸探针序列为： ① 5′ATTGC TATGG GATTT CCTGC AGAAA GACTT3′; ② 5′GGGAG TAACT ATTCC CAGTC AGAGG CGCTA3′; ③ 5′TTCTG ACACC ACTGA CTCTG ATCCA GAGAA3′.
1.2方法
1.2.1标本处理术中所取标本均用多聚甲醛（含1 mL/L DEPC）固定，常规石蜡包埋，5 μm连续切片，每一标本留取4张切片，其中1张做HE染色，明确病理诊断并进行分期，2张做原位杂交染色，1张作为阴性对照.
1.2.2原位杂交严格按照试剂盒说明书进行操作. 将石蜡切片常规脱蜡至水，加30 mL/L h3O2室温处理15 min灭活内源性过氧化物酶，DEPC水洗涤2×5 min. 加胃蛋白酶于37℃消化30 min，暴露mRNA核酸片段，40℃预杂交4 h，滤纸吸干预杂交液滴，40℃杂交过夜. 杂交后梯度SSC溶液洗涤，加封闭液37℃ 30 min，滴加生物素化鼠抗地高辛37℃孵育1 h，滴加SABC室温孵育30 min，滴加生物素化过氧化物酶，室温30 min，以DAB显色，苏木精复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片. 实验过程严格在无RNA酶环境下进行，防止核酶污染后造成的假阴性结果. 实验中以已知阳性的乳腺癌标本作为阳性对照，以PBS代替杂交液作为阴性对照. 实验中所用溶液均加入1 mL/L DEPC灭活RNA酶，4℃静置10 h后，高压灭菌备用.
1.2.3PTEN原位杂交评定标准凡胞质中出现明显的棕黄色颗粒为PTEN mRNA阳性细胞. 根据阳性细胞数量占细胞总数的比例，将阳性表达分为3级： ① 弱阳性（＋），阳性细胞占10%～40%；② 阳性（），阳性细胞占41%～70%；③ 强阳性（），即阳性细胞＞70%，多数细胞呈棕黄色. 染色强度与背景无明显差异或阳性细胞比例＜10%的为阴性（-）.
统计学处理： 采用SPSS11.5软件进行χ2检验和Fishers精确概率，P&<0.05为有统计学意义.
2结果
2.1EMS患者异位内膜及对照正常子宫内膜PTEN的表达PTEN阳性物质为棕黄色颗粒，主要表达于子宫内膜腺上皮细胞胞质和/或胞膜，在腺体周围间质细胞及肌层中偶有表达. PTEN在两组内膜中均有表达，在正常子宫内膜组织中以强阳性或阳性表达为主，在EMS组织中以阴性或弱阳性表达为主(Fig 1A， B)，PTEN在两组内膜组织中的表达水平差异显著(P=0.0002， Tab 1）. PTEN在子宫内膜异位症组和正常对照组内膜的整个月经周期中均可测到，且呈明显的周期性变化. PTEN在增殖期内膜呈低水平表达，分泌期表达增加，但这一差异仅在正常子宫内膜组中有意义(P=0.0102， Tab 1). PTEN mRNA在卵巢巧克力囊肿和子宫肌腺症组织中的表达未见显著性差异（P＝0.4018， Tab 2）.表1PTEN mRNA在子宫内膜异位症及正常子宫内膜中的表达（略）表2PTEN mRNA在卵巢巧克力囊肿和子宫肌腺症组织中的表达（略）
2.2PTEN在子宫内膜异位症不同分级中的表达Ⅰ~Ⅳ期子宫内膜异位症组织中PTEN的表达率变化明显，各组间PTEN的表达率存在显著性差异（P=0.0026， Tab 3）.表3PTEN mRNA在子宫内膜异位症不同AFS分期中的表达（略）
PTEN基因是与细胞生长、凋亡、增殖及黏附等多种细胞生物学行为相关的抑癌基因. 该基因是第1个具有磷酸酶活性的抑癌基因，定位于人常染色体10q23.3，具有9个外显子，其序列内含有1212个核苷酸组成的开放阅读框，编码403个氨基酸组成的蛋白质［2］. 目前有关PTEN基因抑制细胞增殖的机制尚不清楚，但有研究认为，抑癌基因PTEN可能是一种促凋亡因子，过表达的PTEN能增加凋亡细胞的数量，甚至在细胞周期G1期阻滞开始后，亦可增加细胞对凋亡刺激的敏感性［3，4］. PTEN基因的这一功能影响着多种疾病的发生与发展，而近年来的研究已使人们逐步认识到，PTEN基因表达的改变与多种子宫内膜相关病变密切相关［1］.
我们在实验中发现，正常子宫内膜中，PTEN的表达率为93.9%，增生期显著低于分泌期（P=0.0102），推测PTEN基因可能参与了调节子宫内膜的周期性变化： 增殖期内膜PTEN表达水平较低，子宫内膜细胞增生活跃；分泌期内膜PTEN表达水平增高，子宫内膜细胞的凋亡相应增加，为内膜组织的脱落创造条件. PTEN表达的周期性改变与孕激素的周期性变化一致，提示PTEN的表达可能受到性激素的调控，特别是孕激素，对其表达有促进作用［5］. 实验中发现，PTEN在异位子宫内膜中的表达水平与正常子宫内膜相比差异显著（P=0.0002），提示PTEN基因表达的改变可能是EMS发生的机制之一. PTEN的低水平表达使异位内膜细胞的凋亡数量减少，易于异位种植成活. EMS的发生有赖于血管的增生. 有研究证实，PTEN能够通过PI3K/AKT信号途径，在血管生成及调节血管内皮生长因子（VEGF）表达方面发挥重要作用，抑制新生血管的产生［6，7］. 因而推测，PTEN基因表达水平降低使VEGF的表达失去抑制，含量增高，子宫内膜血管生成相应增多，为异位内膜成功种植与生长创造了条件. 但这一结论仍需进一步的实验研究来证实. 不同于正常子宫内膜，异位内膜组织中，增殖期和分泌期PTEN表达水平相似（P=0.6185）. 这一结果是否是由于异位内膜组织中缺乏足量的孕激素或足量的孕激素受体［5］，PTEN基因失去孕激素调控，因而在两期内膜中的表达差异消失，还需要进一步的证实.
EMS有类似于恶性病变的生物学特性. Martini等［8］检测了46名Ⅲ、Ⅳ期EMS患者PTEN基因的表达后指出，PTEN表达水平下降可能作为EMS恶性转化的标志之一. 本实验发现，Ⅰ~Ⅳ期子宫内膜异位症组织中PTEN的表达率变化明显（P=0.0026），与Martini等［8］的实验结论相似. 因此，尽管某些学者对EMS与恶性肿瘤之间的关联持否定态度，但PTEN基因表达的变化仍有望成为EMS恶变早期诊断的有效指标.
总之，抑癌基因PTEN在异位子宫内膜中的表达水平明显降低，PTEN基因参与了EMS的发生. 探究PTEN表达变化在EMS发生发展中的作用，不仅能够进一步明确EMS的发病机制，还可以为其诊断和治疗提供一种新的思路及方法.
【参考文献】
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［8］ Martini M， Ciccanone M， Garganese G， et al. Possible involvement of Hmlh1， p16， PTEN in the malignant transformation of endometriosis ［J］. Int J Cancer， 2002;102(4): 398-406.转贴于