作者：郑奇军，王锐安，蔡振杰，俞世强，欧阳辉，赵建斌
【关键词】 种子细胞
【Abstract】 AIM: To purify and culture human bone marrowderived endothelial progenitor cells (EPCs) in vitro and to observe their biological characteristics. METHODS: Mononuclear cells were isolated from bone marrow suspension by density gradient centrifugation and EPCs were harvested in the endothelial growth medium (EGM2). EPCs were observed under microscope， the cell growth was calculated by cell counting and the cells were identified by electronic microscope examination and immunofluorescence staining for the expression of Ⅷ/vWF， vascular endothelial growth factor receptor2 （VEGFR2）. RESULTS: The culturedishadherent EPCs uniformly had a round or spindle shape and reformed clones with cobblestone morphology. The cells could be identified by the positive staining for VEGFR2 and Ⅷ/vWF. WeibelPaladle bodies could be seen under transmission electron microscope. CONCLUSION: EPCs are one group of stem cells in the bone marrow with the capacity of differentiating into endothelial cells. They can be purified and cultured by density gradient centrifugation and subjected to culture in vitro with endothelial growth medium (EGM2 MV). These findings suggest that EPCs may be a new seed cell of tissue engineering.
【Keywords】 bone marrow; endothelium/cytology; stem cells; tissue engineering; seed cells
【摘要】 目的： 体外分离纯化人骨髓内皮前体干细胞，研究其基本生物学特性. 方法： 利用密度梯度离心法分离成人骨髓得到单个核细胞，再用内皮细胞条件培养基培养得到内皮前体干细胞，观察细胞生长特性，通过检测细胞血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）、Ⅷ因子相关抗原抗体表达和透射电镜对培养细胞进行鉴定. 结果： 原代培养后细胞贴壁生长，7~10 d形成集落或融合呈卵石形，免疫组化荧光染色后结果显示VEGFR2， Ⅷ/vWF 阳性，透射电镜显示细胞内具有特征性的WP小体. 结论： 用密度梯度离心法和条件培养可以从骨髓得到高纯度内皮前体干细胞，该细胞具有与血管内皮细胞共同的特征，可以进一步分化为血管内皮细胞，是理想的组织工程种子细胞.
【关键词】 骨髓；内皮/细胞学；干细胞；组织工程；种子细胞
0引言
随着干细胞研究的深入，研究者发现，内皮前体细胞（endothelial progenitor cells， EPCs）是具有活跃分化潜能的干细胞，具有游走特征并能进一步增殖分化为内皮细胞.它不仅参与胚胎期的血管发育，也存在于成年机体的骨髓和外周血中，在成体血管内皮细胞发育中起重要作用，可以作为种子细胞用于人工血管、组织工程瓣膜内皮化的研究与应用［1］. EPCs的研究愈来愈受到关注，但分离相对困难，关于其培养及生物学特性研究少见报道. 为进一步探讨EPCs作为组织工程种子细胞的可能性与优越性，我们进行人骨髓内皮前体细胞的分离培养和生物学特性的研究.
1材料和方法
1.1材料
骨髓取自健康志愿者. 内皮细胞生长培养基（EGM2， Clonetics， USA），内皮细胞生长培养基补充物（EGM2 MV SingleQuots， Clonetics， USA），其中包含有胎牛血清（FBS）、血管内皮生长因子(VEGF）、成纤维细胞生长因子2(FGF2）、胰岛素样生长因子1(IGF1）以及抗生素等，黏连蛋白（FibronectinFn，Sigma），淋巴细胞分离液与PBS液（TBD公司），胰蛋白酶（Gibco），Hanks平衡盐液（Gibco），VEGFR2兔抗（NeoMarkers，USA），第Ⅷ因子鼠抗(北京中山公司），二抗（FITC羊抗鼠与Cy3羊抗兔，Sigma），FITCconjugated CD34鼠抗（R && D公司）.
1.2方法
1.2.1骨髓中单个核细胞的分离［2］无菌条件下，取人骨髓液5 mL，加入肝素，用PBS液充分混匀，转入离心管，轻轻地层加到1077 g/L的淋巴细胞分离液上，2000 r/min离心20 min，收集中间的单个核细胞层，用PBS液1000 r/min离心洗涤2次×10 min以洗除残余淋巴细胞分离液，然后收集细胞备用.
1.2.2EPCs的培养收集骨髓中单个核细胞，用含胎牛血清和多种生长因子的内皮细胞生长培养基混匀，制成细胞悬液，接种于以黏连蛋白（Fn）包被的培养瓶中，置37℃含50 mL/L CO2孵箱中培养，第4日换液，去除非贴壁细胞，此后每3~4 d换液1次. 相差显微镜下观察细胞形态，待细胞长满瓶底的80%，用0.125 g/L胰酶消化，并以2×107/ L细胞数传入24孔培养板中，每日取4孔细胞进行计数并求均数，绘制细胞生长曲线，计算细胞群体倍增时间.
1.2.3流式细胞仪检测取对数生长期骨髓EPCs， 以0.125 g/L胰酶消化后制备单细胞悬液，测定细胞生长周期；同时，检测细胞表面抗原CD34表达，鉴定所得细胞纯度.
1.2.4EPCs细胞表面抗原免疫荧光染色检测培养10 d的细胞进行免疫荧光化学染色，检测细胞表面抗原VEGFR2与Ⅷ/vWF等表达情况，选取培养10 d的成纤维细胞进行免疫荧光化学染色作为对照组. 过程如下： 细胞片用PBS液洗，然后用40 g/L多聚甲醛常温处理30 min，再用含50 mg/L马血清和50 mg/L小牛血清的PBS液浸泡30 min，去除非特异性标记，再加入VEGFR2， Ⅷ因子mAb （1∶100），37℃孵育过夜，用PBS液洗3次，加入荧光标记二抗，37℃摇床孵育1 h，荧光显微镜下拍照.
1.2.5电镜检查体外培养10 d，离心收集EPCs，用3 g/L戊二醛固定过夜，细胞团用PBS 洗3 次×10 min，1 g/L四氧化锇4℃固定30 min， PBS洗3次×10 min，丙酮系列脱水，包埋并制作超薄切片，透射电镜观察拍照.
2.1骨髓EPCs体外培养及扩增用梯度密度离心法从骨髓中分离出单个核细胞层后，用内皮细胞生长条件培养基培养，并通过换液去除非贴壁细胞，所得贴壁细胞即为骨髓内皮前体细胞. 原代培养4 d内，细胞呈圆形（Fig 1A）；培养7 d后，细胞铺展呈椭圆形或短梭形，并迅速增殖，10 d后出现细胞融合呈“铺路卵石样”（Fig 1B），约14 d可传代. 传代后细胞于24 h内完全贴壁，接种后第1~3日为潜伏适应期，从第4日起细胞增殖迅速并进入对数生长期，第7日达高峰，此后进入平台期，细胞生长曲线如Fig 2所示. 同时，依据生长曲线计算细胞群体倍增时间约为36 h.
2.2流式细胞仪检测贴壁细胞消化后用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34表达，结果显示细胞均一性较好（阳性表达率72%），说明采用本实验中分离细胞的方法可得到较高纯度的骨髓EPCs. 同时，流式细胞仪测定细胞生长周期，结果显示： G0/G1期细胞为71.1%，G2/M期细胞为14.7%，S期细胞为14.2%，说明EPCs细胞增殖比较活跃.
2.3骨髓EPCs表面标记的检测EPCs细胞均表达Ⅷ/vWF，免疫荧光染色呈阳性，细胞胞质呈绿色，胞核不染色（Fig 3A）；EPCs细胞均表达VEGFR2，免疫荧光染色呈阳性，细胞胞质呈砖红色，胞核不染色（Fig 3B）. 对照组成纤维不表达Ⅷ/vWF与VEGFR2，免疫荧光染色呈阴性，细胞胞质和胞核均不染色.
2.4骨髓EPCs超微结构观察细胞边缘可见较多绒毛状突起，胞质内还见一种短棒状小体，即Weibel Palade氏小体，是内皮细胞特征性的细胞器（Fig 4）.
3讨论
近年来研究发现，EPCs具有游走特征并能进一步增殖分化为内皮细胞，它不仅参与胚胎期的血管发育，也存在于成年机体的骨髓和外周血中，在成体血管内皮细胞发育中起重要作用. 1997年Asahara等［3］成功地在体外将CD34+细胞诱导生成血管内皮细胞，并于体内证明其生血管能力，说明EPCs是CD34+细胞重要亚群. 因此，EPCs有望成为血管组织工程内皮种子细胞的新来源.
EPCs是CD34+细胞重要亚群，多采用吸附单克隆抗体－磁珠分离系统(MACS)进行分离得到，此法所得细胞均一性好，纯度高，但价格昂贵，实用价值欠佳，同时，EPCs吞噬的磁性微粒也必然影响细胞的代谢及功能［4］. 本实验中，根据细胞密度的差异，针对EPCs属于单核类细胞的特点，抽取骨髓后，用密度梯度离心法分离出单个核细胞层，再利用内皮细胞生长条件培养基外加黏连蛋白黏附特性，最终所得贴壁细胞即为EPCs. 同时，我们对所得到的骨髓EPCs用流式细胞仪检测表面抗原表达，结果显示细胞均一性较好，CD34阳性表达率72%，也进一步鉴定了所得到的细胞为较高纯度的骨髓内皮前体细胞. 此方法简单、经济、高效，具用较高的应用价值.
VEGFR2是内皮细胞生长的早期表面受体，主要出现在内皮细胞诱导转化的早期［5］. Ⅷ因子是内皮细胞特异性抗原，可以通过vWF的测定对内皮细胞进行鉴定［6］. 本实验中人骨髓EPCs呈贴壁生长，随体外培养时间延长，其形态由早期圆形铺展呈椭圆形或短梭形，并迅速增殖，出现细胞融合呈“铺路卵石样”. 培养一定时间后，细胞增殖速度由快变慢，胞体变大、胞质疏松，提示EPCs增殖活力下降. 原代培养生长曲线显示，EPCs的体外培养经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，其增生分裂能力活跃，体外培养可以实现快速扩增. 此外，分离得到的骨髓EPCs具有与血管内皮细胞共同的特征，细胞呈鹅卵石状贴壁生长，均表达VEGFR2， Ⅷ/vWF，胞质内还可见内皮细胞特异性标记短棒状小体，即Weibel Palade氏小体.
EPCs存在于成年机体的骨髓和外周血中，可以自体取材，避免新的机体创伤和免疫排斥反应. 同时，EPCs增生分裂能力活跃，体外培养可以实现快速扩增，能进一步分化为内皮细胞，参与成体血管内皮细胞发育、创伤愈合、肿瘤生长等病理生理过程［7］. 因此，EPCs可以作为理想的内皮种子细胞来源，用于人工血管、组织工程瓣膜内皮化研究，具有潜在的临床应用价值.
【参考文献】
［1］ Griese DP， Ehsan A， Melo LG， et al. Isolation and transplantation of autologous circulating endothelial cells into denuded vessels and prosthetic grafts: Implications for cellbased vascular therapy ［J］. Circulation， 2003;108(21):2710-2715.
［2］ 郑奇军，蔡振杰，俞世强，等. 骨髓间质干细胞体外定向心肌样分化的实验研究［J］. 第四军医大学学报，2002；23（20）：1871-1873.
Zheng QJ， Cai ZJ， Yu SQ， et al. Experimental study on differentiation of mesenchymal stem cells in bone marrow to cardiomyocytes in vitro ［J］. J Fourth Mil Med Univ， 2002;23(20):1871-1873.
［3］ Asahara T， Murohara T， Sullivan A. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis ［J］. Science， 1997;275(14):964-967.
［4］ Eggermann J， Kliche S， Jarmy G， et al. Endothelial progenitor cell culture and differentiation in vitro: A methodological comparison using human umbilical cord blood ［J］. Cardiovas Res， 2003;58:478-486.
［5］ Mario P， Afzal JN， Daniel P， et al. Expression of VEGFR2 and AC133 by circulating human CD34+ cells identifies a population of functional endothelial precursors ［J］. Blood， 2000;95:952-957.
［6］ Hristov M， Erl W， Weber PC. Endothelial progenitor cells: Mobilization， differentiation， and homing ［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2003;23(7):1185-1189.