作者：陈福权，王锦玲，邱建华，刘顺利，米文娟
【关键词】 增殖细胞核抗原
【Abstract】 AIM: To investigate the changing pattern of apoptosis and proliferation in the development of rat olfactory bulb. METHODS: Olfactory bulbs were taken from embryonic day 14， postnatal day 1 (P1)， 20 (P20) and adult rats and were fixed with 40 g/L paraformaldehyde， followed with paraffinembedding and serial sectioning. Each group consisted of 10 rats. Apoptosis and proliferation were determined with TUNEL and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunofluorescence staining. RESULTS: Apoptosis cells widely distributed and PCNA immunoreactive cells were mainly around the ependymal layer in embryonic day 14 and P1 rat olfactory bulb， and apoptosis and PCNA immunoreactive cells mainly distributed in glomerular layer and granule layer in P20 and adult rat olfactory bulb. Apoptosis and PCNA immunoreactive cells reduced significantly as the rats became mature. CONCLUSION: Apoptosis and proliferation in the rat olfactory bulb reduces gradually from embryo to adult.
【Keywords】 rats; olfactory bulb; apoptosis; proliferating cell nuclear antigen
【摘要】 目的： 探讨大鼠嗅球发育过程中细胞凋亡和增殖的变化规律. 方法： 胚胎14 d，新生1 d (postnatal day， P1)，P20及成年大鼠各10只，取嗅球以40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片. 采用TUNEL和免疫荧光染色方法检测大鼠嗅球中凋亡细胞和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen， PCNA)免疫反应阳性细胞的分布. 结果： 在胚胎14 d和P1大鼠嗅球中，凋亡细胞广泛分布而PCNA免疫反应阳性细胞主要分布在室管膜周围区域，凋亡细胞和PCNA免疫反应阳性细胞在P20和成年大鼠嗅球中主要分布在小球层和颗粒细胞层. 嗅球中的凋亡细胞和增殖细胞随龄逐渐减少，差异有显著性意义. 结论： 大鼠从胚胎到成体嗅球细胞凋亡和增殖逐渐减少.
【关键词】 大鼠；嗅球；脱噬作用；增殖细胞核抗原
0引言
细胞凋亡是中枢神经和周围神经发育过程中的一个重要现象，目的可能是调控神经元和胶质细胞的数量，使之与神经投射目标的大小相一致. 哺乳动物的嗅球存在广泛的细胞凋亡和神经发生. 研究表明，大鼠嗅球出生后第5日凋亡达到高峰，随着发育成熟，细胞凋亡逐渐下降［1］. 成年嗅球内存在大量来自吻侧迁移流的神经干细胞及神经前体细胞，其中一半在3 mo内凋亡，存活的细胞最终分化为小球周围中间神经元［2］. 阻止嗅觉刺激可使颗粒细胞层中间神经元的神经发生和细胞凋亡减少［1］，而增加气味刺激可以促进神经发生［3］. 由于嗅上皮的嗅感觉神经细胞凋亡在胚胎13 d时达高峰［4］，而嗅上皮中嗅感觉神经细胞的发育与嗅球的神经发生有密切的联系，推测胚胎大鼠嗅球也可能存在活跃的细胞凋亡，因此我们采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling， TUNEL)和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen， PCNA)免疫荧光染色法检测大鼠从胚胎到成体嗅球细胞凋亡与增殖的变化，以探讨其变化规律.
1材料和方法
1.1材料
40只二级SD大鼠(第四军医大学实验动物中心提供)分4组： 孕14 d(embryonic day，E14)大鼠被颈椎脱位处死后，打开腹腔，取出10个胚胎，显微镜下取双侧嗅球，新生第1 日(postnatal day， P1)和P20大鼠各10只，颈椎脱位处死后取双侧嗅球，40 g/L多聚甲醛4℃固定24 h；雌性大鼠(6 mo， 200 ~250 g) 10只，速眠新注射液(长春农牧大学兽医研究所，0.8 mL/kg， sc)麻醉，40 g/L多聚甲醛经心脏灌注，取双侧嗅球， 40 g/L多聚甲醛4℃固定12 h. 标本石蜡包埋，连续切片，厚度3 μm. TUNEL检测试剂盒，PCNA小鼠mAb和FITC羊抗小鼠IgG购自博士德生物有限公司.
1.2方法
1.2.1TUNEL检测切片脱蜡至水，0.1 mol/L TBS漂洗后，新鲜配制30 mL/L h3O2室温处理10 min；蛋白酶K（1∶100）室温消化5 min；标本加标记缓冲液室温10 min后甩掉，TdT和DIGdUTP（1∶1）加入标记缓冲液混合，37 ℃标记2 h；封闭液室温20 min；生物素化抗地高辛抗体（1∶100）37 ℃孵育1 h，加SABC 37 ℃反应30 min，DAB显色. 阴性对照省去TdT. 每步骤间以0.1 mol/L TBS漂洗. 切片脱水，透明，封片.
1.2.2免疫组织化学染色切片脱蜡至水，30 mL/L h3O2室温30 min；微波抗原修复；正常山羊血清封闭20 min，甩去，不洗；PCNA小鼠mAb（1∶100）4℃过夜；FITC羊抗小鼠IgG 37 ℃标记1 h. 以上步骤后均以0.1 mol/L PBS漂洗3次. 切片自然干燥，缓冲甘油（80%甘油，20% 0.1 mol/L PBS）封片. 荧光显微镜（Olympus）观察. 阴性对照以PBS代替一抗. 每只动物随机选择5~10个高倍视野，记数1000个神经细胞中的阳性细胞，阳性细胞数和所有计数细胞数的比率为凋亡指数和PCNA增殖指数.
统计学处理： 数据以x±s表示，采用SPSS 10.0统计软件处理，各组间平均数比较采用非参数秩和检验. P&<0.05为具有统计学意义.
2结果
所有染色背景清晰，阴性对照不着色，TUNEL检测阳性产物呈棕红色，PCNA阳性染色呈绿色荧光，均定位于细胞核. E14及P1大鼠凋亡细胞广泛分布于整个嗅球（Fig 1A），P20及成年大鼠凋亡细胞主要分布于小球层、颗粒细胞层和室管膜层周围（Fig 2A）. E14和P1大鼠嗅球PCNA免疫反应阳性细胞集中在室管膜层周围区域，远离室管膜层周围的区域阳性染色细胞少见（Fig 1B），P20和成年大鼠PCNA免疫反应阳性细胞主要分布于小球层和颗粒细胞层，少数位于外丛层（Fig 2B）. 不同发育阶段嗅球凋亡指数和PCNA增殖指数见Tab 1，大鼠从胚胎到成体嗅球凋亡指数和PCNA增殖指数逐渐下降.表1不同发育阶段大鼠嗅球凋亡指数和PCNA增殖指数（略）
本结果表明，大鼠嗅球从胚胎到成年均存在广泛的细胞凋亡，随着嗅球发育成熟，细胞凋亡明显下降. E14和P1大鼠嗅球未发育成熟，没有形成典型的分层样结构，凋亡细胞散在分布；和成年大鼠一样，P20大鼠嗅球已形成分层样结构，凋亡细胞主要分布在小球层和颗粒细胞层. 嗅球发育过程中细胞凋亡的发展规律与嗅上皮一致［5］. 细胞凋亡的一个主要功能是给新生的神经细胞提供轴突生长的空间并维持器官发育的正常形态和功能［6］. 哺乳动物嗅球和嗅上皮神经细胞终生更新，新生的嗅上皮感觉细胞产生通向颅内的轴突，并与嗅球内的二级神经元形成新的突触连接. 神经细胞凋亡和增生主要发生在神经发生和更新活跃的部位在发育早期，嗅感觉神经细胞的轴突投射向整个嗅球，嗅球发育成熟后，轴突点投射，向
小球层和颗粒细胞层，并与其中的中间神经元形成突触连接. 成熟嗅球中来自室管膜下区的神经干细胞主要扩散至小球层和颗粒细胞层［7］，形成新的神经细胞并替换老的神经细胞［2］. 神经细胞过度生成及新老更替是嗅球内细胞凋亡普遍存在的原因. 本结果表明，大鼠从胚胎到成年的发育过程中，嗅球神经的凋亡及增殖现象呈下降趋势. 但嗅球细胞凋亡可能随着衰老逐渐增加［8］. 本结果表明，大鼠嗅球发育早期存在大量的增殖细胞，成年大鼠嗅球中增殖细胞很少，随着嗅球发育成熟，增殖细胞明显减少. 然而，已经证实从胚胎到成年哺乳动物的嗅球中均存在丰富的神经干细胞或神经前体细胞［9， 10］. 嗅球中的神经干细胞主要来源于侧脑室下区，经吻侧迁移流到达室管膜下区并迁移至嗅球，嗅球内本身的神经干细胞较少，主要位于小球层和颗粒细胞层［7］. PCNA是一种核内蛋白质，是DNA聚含酶的附属蛋白，协调DNA前导链和后随链的合成. PCNA的出现与细胞增殖有关，可作为评价细胞增殖状态的一个指标. 嗅球未发育成熟时，嗅球内的神经干细胞可能存在活跃的分裂、增殖，嗅球发育成熟后，侧脑室下区的神经干细胞15 d内到达嗅球，其中50%凋亡，存活的细胞逐渐向小球层和颗粒细胞层迁移并分化为中间神经元［2］，这些细胞可能没有或很少出现分裂、增殖现象，不出现PCNA蛋白. 可能只有嗅球内自身的神经干细胞出现分裂、增殖，形成新的神经元和胶质细胞［11］，而其中有部分神经干细胞可能处于静止状态. 所以，虽然成熟嗅球内存在活跃的神经细胞更新，但嗅球内的原位细胞分裂、增殖较少.
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