作者：张惠文，袁小兵，张拥军，顾学范
【关键词】 苯丙酮尿症
【Abstract】 AIM: To gain more insight into the mechanism of neuronal injury in phenylketonuria patients and to investigate the effect of phenylalanine on intracellular free calcium concentration (［Ca］i) of embryonic rat cortical neurons. METHODS: Calcium imaging was used to observe the influence of Lphenylalanine and its derivatives on ［Ca］i. RESULTS: High concentration of Lphenylalanine (Phe， 10 mmol/L) and DLβphenyllactic acid （PL，10 mmol/L）decreased ［Ca］i， while phenylacetic acid (PAA， 10 mmol/L) decreased， then increased， and again decreased ［Ca］i. With the normal extracellular balance solution replaced by calciumfree and natriumfree balance solution， PL did not change its effect on intracellular free calcium. With Thapsigargin (100 nmol/L) added to the normal extracellular solution to inhibit the sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase（SERCA）， PAA decreased ［Ca］i， and no subsequent increase of ［Ca］i was observed. With the same concentration， PL and PAA had more significant effects on immature neurons. CONCLUSION: Combining the result of gene chips， Lphenylalanine and its derivatives can activate plasma membrane Ca2+ATPase and accelerate the extrusion of intracellular free calcium from neurons， thus resulting in the decrease of ［Ca］i.
【Keywords】 phenylketonuria; calcium imaging; phenylalanine
【摘要】 目的： 探讨苯丙酮尿症患者脑损伤的病理生理机制，分析苯丙氨酸和胞质游离钙有无关系. 方法： 用钙成像技术检测氨基酸及其衍生物对胚鼠皮层未成熟神经元胞质游离钙浓度的影响. 结果： 高浓度苯丙氨酸降低胞质游离钙，苯乙酸使胞质内钙浓度降低后升高最后又降低，苯乳酸使胞质内钙降低更明显. 使用无钙离子无钠离子的细胞外液，苯乳酸降低胞质内钙的作用无明显影响；使用Thapsigargin阻断内质网上钙泵，苯乙酸虽仍能降低胞质内钙，但没有降低后又升高的现象. 当苯丙氨酸、苯乙酸和苯乳酸相同浓度时，苯乙酸、苯乳酸较苯丙氨酸的作用更强. 结论： 结合我们以前的观察结果，苯丙氨酸可能激活plasma membrane Ca2+ATPase，促进神经元胞质内钙外排，进而导致神经元胞质内钙浓度降低.
【关键词】 苯丙酮尿症；钙成像；苯丙氨酸
0引言
苯丙酮尿症是遗传代谢性疾病，由于苯丙氨酸羟化酶基因突变导致的酶活性缺失或者降低，苯丙氨酸不能转化为酪氨酸，体内苯丙氨酸及其衍生物苯乙酸、苯丙酮酸、苯乳酸等贮积. 苯丙酮尿症的研究历史较长，生化研究显示高浓度的苯丙氨酸抑制Na+， K+ATP酶、肌酐激酶活性，电生理研究显示高浓度的苯丙氨酸抑制海马神经元N型钙通道开放，抑制NMDA受体激活，抑制突触前膜谷氨酸释放，抑制突触后谷氨酸能兴奋性电位［1，2］. 我科用基因芯片的方法研究了高浓度苯丙氨酸作用下胚鼠皮层未成熟的原代培养神经元基因表达谱的变化，着重观察了基因芯片中钙离子相关蛋白，发现高浓度苯丙氨酸能增加calmodulinⅠ， Ca2+/calmodulindependent protein kinase， brain typeⅡ， L型Ca2+ channel的基因表达，降低calmodulinⅡ， calcineurin， plasma membrane Ca2+ATPase 2b和2a的基因表达［3］. 因此，本实验拟用钙成像技术检测氨基酸及其衍生物对神经元胞质游离钙浓度的影响.
1材料和方法
1.1胚鼠大脑皮层神经元原代培养孕14 d SD大鼠，取出胚鼠，分离大脑皮层，剥除皮层外软脑膜，1.25 g/L胰蛋白酶37℃消化10 min后，滴入胎牛血清终止消化，加入含B27的神经细胞培养基(Neurobasal， Gibcol). 用细口径吸管反复轻吹打，得到细胞悬液，以中等密度接种于0.5 g/L右旋多聚赖氨酸包被的盖玻片上，盖玻片预置于35 mm的培养皿中，37℃， 50 mL/L CO2培养箱中培养2～7 d备用.
1.2溶液配制标准细胞外液，无钠细胞外液，无钙细胞外液配方见Tab 1. L苯丙氨酸（Lphenylalanine， Phe， Sigma），苯乙酸(phenylacetic acid， PAA， Sigma)，苯乳酸(DLβphenyllactic acid， PL， Sigma)用标准细胞外液配成40 mmol/L. Thapsigargin (Sigma)用标准细胞外液配成100 mmol/L贮存液，保存于-20℃.表1各种细胞外液配方（略）
1.3钙显影方法观察苯丙氨酸及其衍生物对神经元胞质游离钙的影响Fluo4， AM 和FuraredTM， AM(Molecular Probe Inc.) 配成2 mmol/L的二甲亚砜(Sigma， 纯度999 mL/L)溶液，分装后-20℃避光保存备用. 这两种染料有相近的激发光波长（约488 nm）和不同的发射光波长［Fluo4， (530±15) nm; Furared (640±15) nm］. Fluo4的发射光强度随着胞内游离钙离子浓度升高而增加，而Furared的发射光强度随着胞内游离钙离子浓度升高而降低. 平铺于盖玻片上的细胞在细胞外液中洗一次后，与钙指示剂Fluo4（终浓度5 μmol/L）和Furared（终浓度5 μmol/L）室温下孵育30 min，在细胞外液中洗3次后，将细胞置于标本槽中，30 min后共聚焦显微镜（LSM 510， Zeiss公司，德国）载物台上观察. 上述操作避光进行. 标本槽为自制的方形有机玻璃皿，底部用石蜡与一薄玻片封接. 药品以不同细胞外液配成2倍终浓度保存，1 wk内使用. 标本槽中有0.5 mL细胞外液， 给药前均记录5 min对照，然后将0.5 mL的药物沿槽的边缘加入.
1.4荧光图像的记录和［Ca2+］i的计算荧光图像由Zeiss激光扫描共聚焦显微成像系统记录. 仪器和软件设置： 40×/1.3倍油镜，激发光波长为488 nm，CH3和CH4分别是针对485和635 nm波长荧光信号的检测通道. 激光每隔10 s扫描一次细胞，扫描时间1 s，每种药记录13 min.
通过Region of Interest测得细胞区域CH3， CH4通道的荧光强度，计算Fluo3的发射光强度与Furared的发射光强度的比值可以反映胞内游离钙的相对浓度，同时可以消除细胞几何形状对胞内钙浓度测量的影响.
1.5数据处理将每1 min的6张图像的比值取平均值作为该时间段胞质游离钙浓度（ci），将给药前5 min记录的30张图像荧光强度的均值作为胞质游离钙的基础值（c0），利用以下公式计算每分钟胞质游离钙随时间的变化曲线.
2结果
2.1苯丙氨酸对神经元胞质游离钙的影响由于神经元在静息状态下胞质游离钙有自发性的波动，当胞质内钙在基础值上下10%变化时我们不认为是药物的作用. 以此作为标准，用Fluo4和Furared联合作为钙指示剂时，10~20 mmol/L苯丙氨酸降低神经元胞质游离钙浓度；而当浓度降至5 mmol/L时，观察不到明显的胞质游离钙变化. 5~20 mmol/L的酪氨酸对胞质游离钙无明显影响（结果未显示）(Fig 1).
2.2苯乳酸对神经元胞质游离钙的影响从Fig 2可以看到高浓度苯乳酸降低胞质游离钙，当苯乳酸浓度在5 mmol/L时，胞质游离钙先降低后逐渐升高，而当浓度为1 mmol/L时，胞质游离钙有升高的趋势.
2.3苯乙酸对神经元胞质游离钙浓度的影响10 mmol/L苯乙酸使胞质游离钙降低后升高，最后又降低. 加入Thapsigargin （终浓度100 nmol/L）到细胞外液中，胞质内钙轻度升高. 加入Thapsigagin 3 min后，再加入10 mmol/L苯乙酸，胞质内钙持续降低，此后没有升高现象(Fig 3). 说明10 mmol/L苯乙酸使胞质游离钙降低后升高，是因为内质网钙库释放钙离子到胞质.
2.4低pH值盐酸对神经元胞质游离钙浓度的影响由于苯乙酸、苯乳酸为酸性物质，10 mmol/L苯丙氨酸、苯乙酸、苯乳酸的pH值分别为7.30， 4.12， 3.66， 为了分析苯丙氨酸、苯乙酸、苯乳酸降低神经元胞质游离钙的作用是否由于这些物质的化学特性酸性引起，我们将pH值为3.66 HCl溶液作用于神经元，发现胞质游离钙浓度升高(Fig 4).
2.5不同细胞外液条件下苯乳酸对神经元胞质游离钙浓度的影响使用无钠溶液细胞外液替换标准细胞外液，阻断神经元胞膜Na+/Ca2+交换; 使用无Ca2+的细胞外液，以阻断胞外钙流入细胞内，再加入10 mmol/L苯乳酸，均能使胞质游离钙降低. 在无钠溶液细胞外液中，10 mmol/L苯乳酸使胞质钙有短暂轻度升高(Fig 5).
3讨论
钙离子是真核细胞内最普遍的第二信使［4，5］. 胞质游离钙浓度由进入胞质的钙和离开胞质的钙两方面的因素决定. 细胞外钙通过钙通道进入胞质或者内质网或者肌质网释放钙进入胞质，都可使胞质游离钙升高. 胞质内钙可通过细胞膜Ca2+ATPase （Plasma Membrane Ca2+ATPase， PMCA）和Na+/Ca2+交换子离开胞质，也可通过内质网或者肌质网上的Ca2+ATPase (sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase， SERCA)回到内质网或者肌质网. 线立体能螯和部分钙离子然后缓慢释放到胞质［6］. 使胞质游离钙增多的疾病很常见，如老化、阿尔茨默氏病、缺血缺氧性脑病. 使胞质静息游离钙降低的疾病少见，我们仅检索到酸性磷脂酸和铅中毒时铅降低胞内游离钙浓度的相关文献［7，8］.
临床资料提示氨基酸和钙有一定关系. 饮食中富含高氨基酸会引起高钙尿症. 苯丙酮尿症患儿有骨质疏松、高钙血症、高钙尿症等症状［9］. Kostyuk等［10］ 用电压钳记录PC12细胞的高压激活钙通道，胞内注射20 μmol/L苯丙氨酸使该通道电流降低(38±15)%，Dzhura等［11］提取PKU模型大鼠脑的mRNA，注入到非洲爪蟾的卵母细胞内，通过双电极膜片钳记录到高压激活的钙通道电流，其电流明显低于注入正常鼠脑mRNA的卵母细胞. 胃肠道细胞、甲状旁腺细胞、少突胶质细胞的胞膜存在一种钙受体（calcium sensing receptor， CaR），其生理性配体主要是细胞外钙. 已经证实L型氨基酸，特别是芳香簇氨基酸，苯丙氨酸，色氨酸能激活膜上的钙受体［12］. CaR在大脑主要表达于少突胶质细胞和下丘脑神经元，本实验所用标本是大脑皮层的神经元，所以我们没有观察到如Conigrave等［12］报道的现象. 本实验所用的苯丙氨酸及其衍生物浓度较高，当使用低浓度时，观察不到神经元明显的反应，这可能也与我们所用的检测方法相关，钙成像没有电生理方法敏感. 我们用基因芯片方法研究苯丙氨酸对未成熟原代神经元基因表达谱的影响时所用的浓度是0.9 mmol/L，基因芯片的结果即显示与钙相关的蛋白表达水平发生改变.
本实验观察到，虽然苯丙氨酸及其衍生物最后都是降低神经元胞质游离钙浓度，但它们的影响模式不一致. 不同浓度的苯丙氨酸一直降低神经元胞内游离钙，酪氨酸对神经元胞内游离钙无明显影响，而苯乙酸及苯乳酸对神经元胞内钙的影响比较复杂，可能与苯乙酸及苯乳酸的酸性特别强有一定关系. 用与10 mL苯乳酸相同pH值的稀盐酸加到细胞外液中，结果神经元胞质游离钙升高，这也和以前报道一致［13］： 酸中毒时氢离子可以激活神经元内质网钙库，使胞质钙升高. 单独使用苯乙酸时，神经元胞质内钙降低后有一升高现象；先用Thapsigargin抑制内质网上的SERCA，再加入苯乙酸，则只有降低而无升高现象. 推测苯乙酸使神经元内钙升高是由于苯乙酸的酸性引起的. 近年来发现苯乙酸和苯乳酸有特殊的药理学作用. 如苯乙酸可以单独或者联合维甲酸诱导多种肿瘤细胞分化［14］，在面粉内加苯乳酸有抗真菌作用［15］.
氨基酸不仅可以作为蛋白质合成的底物，它可在基因转录、蛋白翻译、蛋白降解等不同水平调节细胞的功能. 不能透过细胞膜和不能继续被细胞代谢的亮氨酸和苯丙氨酸的类似物能引起与亮氨酸和苯丙氨酸作用一致的结果，可能细胞膜上就存在着氨基酸受体或者感受器，识别不同的氨基酸，引起胞内信号转导［20］. 在酵母细胞膜上发现了能感受胞外氨基酸浓度的复合体Ssy1pPtr3pSsy5p［21］. PMCA是否是膜上苯丙氨酸的感受器，是否苯丙氨酸通过PMCA影响胞质内钙离子浓度，进而引起一系列胞质内反应还需进一步研究.
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