作者：卫小红，杜凤兰，王鸿雁
【关键词】 非小细胞肺癌
【Abstract】 AIM: To investigate the correlation between the expression of transforming growth factor beta (TGFβ) and the angiogenesis in nonsmall cell lung cancer (NSCLC). METHODS: MVC and expression of TGFβ1 in 50 carcinomatous specimens and expression of TGFβ1 in 35 paracarcinomatous specimens from the same 50 cases with NSCLC were detected by SP immunohistochemistry. RESULTS: Active angiogenesis in NSCLC was detected and it was related with NSCLC progression and lymph node metastasis， but not related with histological types. Significant difference of the expression of TGFβ1 was found between stage Ⅰ and Ⅱ (P&<0.05)， and between stage Ⅰ and Ⅲ (P&<0.05)， and the positive expression of TGFβ1 was significantly higher in the patients with lymph node metastasis than those without lymph node metastasis (P&<0.01). No significant association was found between the TGFβ1 expression and the characteristics of the histological types in NSCLC. Positive TGFβ1 expression in carcinomatous specimen was stronger than that in paracarcinomatous specimen. TGFβ1 expression was correlated with tumor angiogenesis. CONCLUSION: TGFβ highly promotes the progression and lymph node metastasis of NSCLC， mainly by stimulating angiogenesis.
【Keywords】 NSCLC; TGFβ; angiogenesis; immunohistochemistry
【摘要】 目的：研究血管生成与转化生长因子β（TGFβ）在非小细胞肺癌（NSCLC）的表达及其相互关系. 方法：通过应用SP免疫组化方法检测50例NSCLC组织内微血管计数（MVC）及50例NSCLC组织和35例癌旁组织中TGFβ1的表达. 结果：NSCLC癌组织中存在活跃的血管生成，血管生成与病变分期进展和淋巴结转移有关，与组织分型无关. TGFβ1阳性表达在NSCLC的I期与II期及I期与III期之间有显著意义（P&<0.05），与淋巴结转移有关，与NSCLC组织分型无关；NSCLC中TGFβ1表达与癌旁组织中比较有显著意义（P&<0.05）；TGFβ1阳性表达与肿瘤血管生成有关. 结论：TGFβ主要通过促肿瘤血管生成而促进了NSCLC的病期进展和淋巴结转移.
【关键词】 非小细胞肺癌；转化生长因子β；血管生成；免疫组织化学
0引言
肿瘤的血管生成（angiogenesis）与肿瘤的发生、发展和转移的全过程密切相关. 肺癌细胞通过合成、分泌血管生成因子调节肿瘤组织的血管生成从而影响肺癌的发生、发展和转移，其中的转化生长因子β(transforming growth factorβ， TGFβ)在原发性肺癌的表达、生物学作用及其与血管生成的关系为人们所关注. 为进一步了解其在非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer， NSCLC）的进展和转移中的表达及与血管生成的关系，我们采用免疫组化的方法对TGFβ1在非小细胞肺癌及癌旁组织中的表达及其与肿瘤血管生成的关系进行了观察.
1材料和方法
1.1材料
199801/200012经手术切除的NSCLC标本50(男35，女15)例， 年龄33～85（平均58士9）岁. 其中35例含癌旁组织. 鳞癌29例，腺癌21例（包括肺泡细胞癌3例）. TNM I期18例，II期20例，III期12例. 有肺门、纵隔淋巴结转移32例，无淋巴结转移18例. 兔抗人多克隆TGFβ1抗体，浓度1∶60（武汉博士德生物技术公司）；鼠抗人VIII因子相关抗原抗体，浓度1∶100（北京中山生物技术有限公司）；链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒（福州迈新生物技术开发公司）等.
1.2方法
石蜡标本切成5 μm厚度切片，脱水、透明、中性树胶封片. 严格按照产品说明书进行SP免疫组化染色. 取已知含有待检抗原的切片作为阳性对照，用PBS缓冲液代替第一抗体同上方法染色作为阴性对照. TGFβ1表达以每张切片不少于3个视野中的细胞内棕黄色颗粒状染色，且着色明显高于背景或背景不着色而细胞着色者为阳性表达. 按染色强度（未着色、弱、中、强）及染色阳性细胞的百分数（0%，1%～25%，26%~50%，&>50%），分别积分为0，1，2，3，两项分数之和为0～2分者计为染色（-），3～6分者计为染色（＋）. 以癌旁间质细胞中出现同上染色颗粒为癌旁组织阳性表达. 微血管计数（microvessel count， MVC）按照Fontanini（J Pathol， 1995;177:57）的方法，用抗FVIIIRA mAB标记血管内皮细胞，可见呈棕色或棕黄色染色的血管内皮细胞，先在低倍镜（4×15）下观察确定微血管数量最多的部位，再在高倍镜（10×15）下，以与周围细胞和结缔组织成分明显区别的任何一个棕色染色的内皮细胞、或细胞丛为一个血管，只要结构不相连，其分支结构也计作一个血管计数. 肿瘤内硬化区及与肿瘤交界处软组织内的微血管，有厚的平滑肌及管腔直径大于8个红细胞的血管除外. 在高倍镜下分别计数3个视野内取其平均值即为该例的平均MVC.
统计学处理: 数据以x±s表示，采用SPSS 11.0软件进行统计分析，多组间均数比较采用方差分析，两两组间比较采用最小显著差法；两组间均数比较采用t检验，方差不齐时采用非参数检验；计数资料采用χ2
2结果
2.1NSCLC组织中的微血管生成NSCLC患者50例的平均MVC为（16.0±4.7）/HP，鳞癌、腺癌的平均MVC值分别为(15.5±4.2)，(17.1±5.7)/HP，二者无统计学差异（P＞0.05）；癌组织与癌旁组织比较有显著统计学意义（P&<0.05），提示NSCLC癌组织中存在活跃的血管生成（Fig 1），但血管生成与组织分型无关. II期与III期患者的平均MVC［（18.4±3.5)/HP，(21.5±2.5）/HP］差别有显著性（P&<0.05），但II期和III期患者的MVC高于I期患者（10.9±4.1），其差别有显著性（P&<0.01），提示临床分期越晚，平均MVC越大，血管增生越活跃. 32例有淋巴结转移患者的平均MVC［（19.7±5.0）/HP］高于18例无淋巴结转移患者（11.4±5.3），其差别具有显著性统计学意义（P&<0.05），可见NSCLC中的血管生成与淋巴结转移有关(Tab 1).
2.2TGFβ1在NSCLC组织中的分布在50例NSCLC中30例可检测到TGFβ1表达（Fig 2），阳性表达产物主要分布于癌细胞的胞质内（Fig 2A，B）；癌旁组织中检测到的TGFβ1蛋白表达主要分布于间质细胞胞质内和极少数吞噬细胞胞质内（Fig 2C，D）. 癌组织TGFβ1阳性率高于癌旁组织（P&<0.05），但不同组织分型之间无统计学差异. 在III期NSCLC患者中TGFβ1的阳性表达高于Ｉ期患者，有显著性差异（P&<0.05）；有淋巴结转移者TGFβ1表达率高于无淋巴结转移者（Fig 2）. TGFβ1表达阳性30例患者的平均MVC为(15.7±5.6)/HP，20例TGFβ1表达阴性患者的平均MVC为(12.1±3.0)/HP，二者间有统计学差异（P&<0.05）.表1MVC与NSCLC组织分型、分期和淋巴结转移的关系
3讨论
肿瘤的发生、发展和转移伴随着新生血管的形成［1］. 肿瘤组织内MVC反映了新生血管生成的强度. 本结果表明NSCLC中存在活跃的血管生成，与癌旁组织比较有统计学差异（P&<0.05），但鳞癌和腺癌之间MVC无统计学差异，II期和III期患者MVC均明显高于Ｉ期患者（P&<0.05），提示随病期的进展，血管生成增加. 有淋巴结转移的患者的MVC高于无淋巴结转移者，则提示新血管的生成. 因此MVC是关系NSCLC进展、影响预后的重要指标，也是预测NSCLC转移及预后的一项独立指标. TGFβ是一种多功能的细胞因子，可由人NSCLC分泌，以TGFβ1含量最高且具有代表性，与分布在细胞上的TGFβ受体结合发挥其促进细胞转化和分化、抑制免疫以及刺激细胞外基质增殖的生物学作用［2， 3］. TGFβ参与了肺癌病期的进展，其表达随着病变的进展而增加，可以作为反映NSCLC患者病期进展的指标. 本结果还显示，在有淋巴结转移的病例中TGFβ1表达明显高于无淋巴结转移的病例（P&<0.01），提示增加的TGFβ可能提高了非小细胞肺癌淋巴结转移的风险.
NSCLC细胞由于其异常的生物代谢，可通过合成、分泌血管生成因子和血管生成抑制因子调节肿瘤组织的血管生成［4］. 体外实验表明TGFβ通过对VEGF的旁分泌调节作用促进内皮细胞的长入和毛细血管腔的形成，因此促进血管内皮细胞的生长而发挥了促肿瘤血管生成作用［5］.
参考文献
［1］ Cox G， Jones JL， Walker RA， et al. Angiogenesis and nonsmall cell lung cancer ［J］. Lung Cancer， 2000; 27(2): 81-100.
［2］ Kang Y， Prentice MA， Mariano JM， et al. Transforming growth factorbeta 1 and its receptors in human lung cancer and mouse lung carcinogenesis ［J］. Exp Lung Res， 2000; 26(8): 685-707.
［3］ Wieser R. The transforming growth factorbeta signaling pathway in tumorigenesis ［J］. Curr Opin Oncol， 2001; 13(1): 70-77.
［4］ Kumar R， Kuniyasu H， Bucana CD， et al. Spatial and temporal expression of angiogenesis molecules during tumor growth and progression ［J］. Oncol Res， 2000; 10(6): 301-311.
［5］ Hasegawa Y， Takanashi S， Kanehira Y， et al. Transforming growth factorbeta 1 levels correlates with angiogenesis， tumor progression， and prognosis in patients with nonsmall cell lung carcinoma ［J］. Cancer， 2001; 91(5): 964-971.转贴于