作者：王祥贵， 冯义柏， 曾秋棠， 周志明， 朱利民
【关键词】 同型半胱氨酸
【Abstract】 AIM: To investigate the effects of homocysteine (Hcy) on the proliferation and apoptosis of human vascular smooth muscle cells (HVSMCs) cultured in vitro. METHODS: HVSMCs were cultured in vitro. The rate of proliferation of HVSMCs was detected by MTT assay and the rate of apoptosis of HVSMCs was detected by flow cytometry. RESULTS: The absorbance value of HVSMCs incubated with 100， 200， 500 and 1000 μmol/L Hcy for 24 h was significantly higher respectively than that of the control group （P&<0.05），revealing that Hcy could induce the proliferation of HVSMCs in a dosedependent manner （r=0.94，P&<0.01）. The rate of apoptosis of HVSMCs incubated with 200， 500 and 1000 μmol/L Hcy for 24 h was significantly higher respectively than that of the control group （P&<0.05），showing that Hcy could induce the apoptosis of HVSMCs in a dosedependent manner （r=0.85， P&<0.05）. CONCLUSION: Hcy can induce the proliferation and apoptosis of HVSMCs， which may be one of the mechanisms involved in atherosclerotic effects of Hcy.
【Keywords】 homocysteine； muscle， smooth， vascular； proliferation； apoptosis
【摘要】 目的：探讨同型半胱氨酸(Hcy)对人血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和凋亡的影响. 方法：采用组织贴块法体外培养人VSMC，MTT法检测人VSMC增殖，流式细胞术检测人VSMC凋亡. 结果：体外培养的人VSMC在终浓度为100， 200， 500和1000 μmol/L Hcy的培养液中孵育24 h后的A值均高于对照组(P&<0.05)，表明Hcy可诱导人VSMC增殖，而且呈浓度依赖性诱导人VSMC增殖（r=0.94，P&<0.01）. 终浓度为200， 500和1000 μmol/L Hcy时细胞凋亡率显著高于对照组(P&<0.05），表明较高浓度的Hcy可以诱导人VSMC凋亡，而且这一效应呈浓度依赖性（r=0.85，P&<0.05）. 结论：Hcy可以诱导VSMC增殖和凋亡.
【关键词】 同型半胱氨酸； 肌，平滑，血管； 增殖； 凋亡
0引言
血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell， VSMC）是动脉粥样硬化（atherosclerosis， AS）斑块的主要细胞成分，VSMC增殖是AS发展过程中的关键变化. 但最近发现在正常血管和AS各个阶段的VSMC都存在细胞凋亡，在正常血管和早期AS的VSMC中仅有极少量细胞发生凋亡，而晚期则有大量细胞凋亡. 同型半胱氨酸(homocysteine， Hcy)是AS的一个新的、重要的、独立的危险因素，但其致AS作用的机制尚未完全阐明. 已有研究表明，Hcy可以诱导VSMC增殖，但对VSMC凋亡的影响研究较少. 我们观察Hcy对体外培养的人VSMC增殖与凋亡的影响，旨在探讨Hcy致AS作用的机制.
1材料和方法
1.1材料
DME培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium， DMEM）、胎牛血清、新生牛血清(Gibco公司); 胰蛋白酶、转铁蛋白(Sigma公司); 胰岛素、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetie aeid， EDTA）、青霉素、链霉素、无钙镁DHanks液；同型半胱氨酸（Sigma公司）；四甲基偶氮唑盐(3［4，5dimethylthioazol2yl］2，5diphenyltetrazolium bromide， MTT)（军事医学科学院）；二甲基亚砜（dimethyle sulfoxide，DMSO），annexinV异硫氰酸荧光素/碘化丙锭 ( fluorescein isothiocyanate / propidiumiodid， FITC/PI)标记试剂盒(奥地利Bender Medsystem公司). 人VSMC采用组织贴块法培养. 取无菌的新鲜的人脐带，剪取动脉中膜部分并剪成约0.5~1.0 mm3大小的血管小块，以3～5块/mm2密度均匀种植于培养瓶底，采用DMEM培养液，在37℃ 50 mL/L CO2培养箱(湿度100%)内静置， 进行VSMC原代培养和传代培养. 在倒置显微镜下进行观察，并作αactin肌动蛋白免疫组化检测. 取5~10代细胞用于实验，随机将细胞分为O(对照组)、100， 200， 500和1000 μmol/L Hcy共5组(n=6)孵育24 h.
1.2方法
VSMC增殖的检测采用MTT比色试验检测. 在培养结束时， 弃去培养液，用PBS洗2次，每孔加无血清培养基100 μL和5 g/L MTT 10 μL培养4 h，每孔吸取80 μL培养液，加DMSO 100 μL，转入Eppendorf (EP)管，用DMSO稀释至310 μL，立即在U2000型紫外与可见光分光分析仪570 nm下读取吸光度A值. 每组重复测6次（n=6）. VSMC凋亡的检测采用annexinV FITC/PI标记试剂盒标记和流式细胞术(flow cytometry， FCM)分析. 在培养结束时，PBS洗涤细胞1次，加入1∶1的0.2 g/L EDTA和2.5 g/L胰蛋白酶溶液1 mL消化细胞，培养箱内消化1 min，待细胞变形后加等量含100 mL/L血清的DMEM，吹打，1500 r/min离心5 min；按1∶4稀释结合缓冲液于蒸馏水中；取不同组的细胞，用缓冲液洗涤1次；悬浮细胞于预稀释的结合缓冲液中，调整细胞浓度至5×108/L；取细胞悬液195 μL与annexinV FITC 5 μL室温混合，避光孵育10 min；缓冲液洗涤；加20 mL/L PI储存液10 μL；室温避光30 min后，FCM分析凋亡细胞. 每组重复测6次（n=6）.
统计学处理：实验数据以x±s表示，应用SPSS 10.0统计学软件进行处理，计量资料采用方差分析，计数资料采用卡方检验，细胞凋亡率及A值与Hcy浓度的关系采用直线相关分析，以P&<0.05为差异具有显著性.
2结果
接种后5~8 d即有细胞从组织块周围长出，呈放射状排列；8~10 d细胞进入对数生长期，呈多层、极性排列；10~15 d在组织块附近首先出现峰与谷结构；15~20 d组织块间细胞相互融合，VSMC呈长梭状、带状或三角状. 传代后6 h细胞已贴壁，4~5 d长成致密细胞层，呈多层、极性排列. 经αactin肌动蛋白免疫组化显色后，低倍镜下可见细胞普遍呈阳性反应，高倍镜下可见αactin肌动蛋白在胞质内均匀分布，表明为典型VSMC（Fig 1）.
2.2Hcy对人VSMC凋亡的影响流式细胞术检测结果显示，体外培养的人VSMC在终浓度为100 μmol/L Hcy的培养液中孵育24 h后的细胞凋亡率［（2.79±0.12)%，n=6］与对照组［（2.68±0.23)%，n=6］比较差异无显著性，但在终浓度为200， 500和1000 μmol/L Hcy的培养液中孵育24 h后的细胞凋亡率［分别为(8.45±1.75)%， (13.37±3.74)%， (23.75±4.68)%，n=6］均显著高于对照组（P&<0.05），直线相关分析示细胞凋亡率与Hcy浓度呈显著正相关（r=0.85，P&<0.05），表明较高浓度的Hcy可以诱导人VSMC凋亡，而且这一效应呈浓度依赖性.
3讨论
VSMC是AS斑块主要的细胞成分，其过度增殖与过度凋亡构成了AS斑块形成的主要病理基础. Hcy是一种含硫氨基酸，高Hcy血症与AS性疾病密切相关，闫韵洪等［1］证实，Hcy水平与冠状动脉AS狭窄程度密切相关，在预测冠心病的发作中是一敏感而可靠指标. Hcy被认为是AS的一个新的、重要的、独立的危险因子，但其致AS作用的机制尚未完全阐明. 唐梦熊等［2］的研究提示，高Hcy血症可促进冠心病患者血浆ET水平增高，NO水平降低，加重血管内皮功能紊乱，但不支持Hcy通过氧化应激抑制损伤人体血管内皮功能的假说. 研究表明［3］，Hcy的致AS作用可能与其促进VSMCs的增殖、导致血管内皮功能障碍以及其致炎、促凝和促氧化等作用有关. VSMC增殖是AS的一个特征性病理改变， 而Hcy可促进VSMC增殖. 本结果表明Hcy诱导VSMC增殖可能是其致AS作用的机制之一.
Patel等［4］发现VSMC凋亡在AS斑块的形成、发展和破裂中起重要作用. Buemi等［5］研究表明，人股动脉VSMC在10~20 mmol/L Hcy孵育24 h后，细胞凋亡数目呈浓度依赖性增加. 本结果显示，人脐动脉VSMC在0.1 mmol/L Hcy孵育24 h后，细胞凋亡无明显增加，但在0.2~1.0 mmol/L Hcy孵育24 h后，细胞凋亡明显增加，而且这一效应呈时间依赖性. 提示Hcy的致AS作用可能与其诱导VSMC凋亡的作用有关.
参考文献
［1］ 闫韵洪，张利华. 同型半胱氨酸与冠状动脉粥样硬化的相关性［J］. 心脏杂志，2002；14：303-304.
Yan YH， Zhang LH. The relationship between homocysteine and coronary artery atherosclerosis［J］. Chin Heart J， 2002;14: 303-304.
［2］ 唐梦熊，黄文增，张步延，等. 血浆同型半胱氨酸对冠心病患者血管内皮功能的影响［J］. 心脏杂志，2002；14：305-309.
Tang MX， Huang WZ， Zhang BY， et al. The effect of plasma homocysteine on endothelial secretive function in coronary heart disease patients［J］. Chin Heart J， 2002;14: 305-309.
［3］ Gauthier GM， Keevil JG，McBride PE. The association of homocysteine and coronary artery disease［J］. Clin Cardiol，2003;26：563-568.
［4］ Patel VA， Zhang QJ， Siddle K， et al. Defect in insulinlike growth factor1 survival mechanism in atherosclerotic plaquederived vascular smooth muscle cells is mediated by reduced surface binding and signaling［J］. Circ Res， 2001; 88:895-902.
［5］ Buemi M， Marino D， Di Pasquale G， et al. Effects of homocysteine on proliferation， necrosis， and apoptosis of vascular smooth muscle cells in culture and influence of folic acid［J］. Thromb Res， 2001; 104: 207-213.