作者：薛莹，姜泓，高雪，柏银兰，师长宏，张海，徐志凯，李元
【关键词】 结核分枝杆菌
【Abstract】 AIM: To obtain Rv2450 gene segments of Mycobacterium tuberculosis (Mtb)， express them efficiently in E.coli and purify the aim proteins. METHODS: Rv2450 gene segments were amplified by PCR with specific primers from genome of Mtb H37Rv strain. After sequenced， Rv2450 gene segments were subcloned into expression vector pProEX HT and purified in E.coli DH5α. Recombinant 6×His fused proteins were purified via NiNTA purification system. RESULTS: The length of PCR products was 529 bp and identical with what the GenBank reported. SDSPAGE analysis showed that the fusion protein mainly existed in inclusion bodies. We isolated the inclusion bodies from the culture and purified the fusion protein under denaturing condition using metal chelate affinity chromatography. CONCLUSION: The construction of the recombinant expressing plasmid lays a basis for further study of Rv2450 protein.
【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis; cloning; expression; purification
【摘要】 目的：克隆结核分枝杆菌（Mtb）Rv2450基因，序列测定正确后进行融合表达、纯化. 方法：采用聚合酶链反应（PCR）从Mtb H37Rv基因组中扩增出Rv2450编码基因，序列测定正确后，亚克隆到融合表达载体pProEX HT中，转化大肠杆菌DH5α，目的基因经IPTG诱导，由T7启动子调控表达带6个组氨酸残基的Rv2450蛋白，在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化. 结果：得到融合6个组氨酸残基的Rv2450蛋白纯度大于90%. 结论：构建了Mtb Rv2450基因的重组表达载体，并获得了高纯度的融合表达蛋白.
【关键词】 结核分枝杆菌；克隆；表达；纯化
0引言
近年来，结核病的发病率迅速回升，成为世界性的问题. 目前，全世界约有1/3的人感染，每年约800万的新发病例和300万的患者死亡，因而寻找更有效的替代卡介苗的疫苗已成为当务之急. Rv2450蛋白是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis， Mtb) RPF蛋白家族的一员，序列分析发现，它不仅与细菌的增殖有关，还有可能是宿主免疫系统识别的一个靶抗原［1］. 因此我们克隆表达并纯化Rv2450蛋白，以期进一步研究其免疫特性，评价其是否可作为候选结核亚单位疫苗的组分.
1材料和方法
1．1材料
7H9液体培养基购自Difco公司；Mtb H37Rv株为陕西省结核病防治研究所惠赠；Taq DNA聚合酶，dNTPs，T4连接酶，HindⅢ，BamHⅠ及DNA电泳胶1回收试剂盒、pGEM Teasy质粒购自Promega公司； E.coli DH5α和pProEX HT质粒为本室保存；金属鳌合亲和层析介质（NiNTA）购自Qiagen公司.
1．2方法
Mtb Rv2450全基因序列的特异性引物序列为：P1：5′GCGGATCCAAGAACGCCCGTACGACG3′，含BamHⅠ酶切位点；P2：5′GCAAGCTTTGCGTCTTTTCGCGGTGG3′，含HindⅢ酶切位点和终止码. 均由西安隆恩公司合成. 取少量Mtb H37Rv株接种于7H9液体培养基中，37℃培养2 wk. 取5 mL液体培养物以9000 g离心10 min，将沉淀重悬于50 μL裂解液（10×PCR缓冲液5 μL，45 g/L吐温20 5 μL，45 g/L NP40 5 μL，20 g/L蛋白酶K 0.5 μL及水34.5 μL）中，置于55℃水浴1 h，95℃水浴10 min使蛋白酶K灭活，再以9000 g离心1 min，取上清，用酚氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于20 μL水中备用. 以Mtb H37Rv基因组为模板，以P1和P2为引物做PCR，经30个循环后，用PCR产物清洁试剂盒回收PCR产物. 然后将其与pGEM Teasy载体按3∶1的比例混合，用T4连接酶连接，转化用CaCl2低温制备的E.coli DH5α感受态细胞. 然后涂布于LB平板（含氨苄青霉素100 mg/L），以蓝白法随机筛选6个白色菌落，分别接种于5 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，碱裂解法提取质粒DNA. 将提取的质粒DNA用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，37℃ 2 h，进行10 g/L的琼脂糖凝胶电泳，以DL2000为分子大小参照，观察有无约529 bp大小的片段，然后随机挑取2个克隆进行测序. 碱裂解法提取pGEM Teasy重组克隆质粒，用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因条带，溶于20 μL水中. 取目的片段和同样用HindⅢ和BamHⅠ双酶切的pProEX HT质粒以1∶1的比例混合，用T4连接酶连接，转化用CaCl2低温制备的E.coli DH5α感受态细胞. 然后涂布于LB平板（含氨苄青霉素100 mg/L），37℃培养过夜. 随机挑取6个菌落，分别接种于5 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜. 各取3 mL碱裂解法提取质粒DNA，再以HindⅢ和BamHⅠ双酶切鉴定，挑选阳性克隆. 将4个阳性克隆分别接种于5 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养18 h，分别取50 μL加到5 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养2~3 h，IPTG诱导4 h，进行120 g/L SDSPAGE，并通过凝胶薄层扫描测定其表达量.
将所构建的重组菌pProEX HT2450在选择LB培养液中37℃振荡培养18 h，取50 μL加到5 mL选择LB培养液中37℃振荡培养2~3 h ，1 mmol IPTG诱导4 h，进行120 g/L SDSPAGE，并转移至硝酸纤维素膜上，用10 g/L BSA封闭过夜，加抗组氨酸的特异性mAb作用1 h，以10 mmol/L PBS（pH 7.2）洗涤后，加HRP标记的羊抗鼠IgG作用1 h，以DAB显色观察表达产物. 将制备好的包涵体重悬于20 mL缓冲液A中，室温搅拌2 h，使包涵体完全溶解，10 000 g离心30 min后，将上清液加入到用缓冲液A平衡过的NiNTA agarose柱上，然后分别用5倍柱床体积的缓冲液B，10倍柱床体积的缓冲液C，2倍柱床体积缓冲液D，2倍柱床体积缓冲液E洗柱，最后用10 mL缓冲液F对目的蛋白进行洗脱，分步收集，每管约1 mL. 取各管收集液15 μL，加入等量2×上样缓冲液，37℃温育10 min，经120 g/L SDSPAGE检测，将含有目的蛋白的各管合并，在变性条件下纯化融合Rv2450蛋白［2］. 采取逐步降低尿素浓度的方法，除去蛋白溶液中的尿素，使变性的蛋白在此过程中自然复性，先用含6 mol/L尿素的缓冲液4℃透析过夜，然后分别用4， 3， 2， 1和0.5 mol/L尿素的梯度透析各4 h以上，最后用PBS缓冲液再透析4 h以上. 透析结束后，将蛋白溶液在4℃下10 000 g离心10 min，上清即为可溶的复性蛋白，将其分装后冻干备用.
2结果
2．1Rv2450基因的扩增、克隆及序列分析应用上述合成的两种引物，以分支杆菌H37Rv基因组为模板，扩增Rv2450的基因序列，取PCR产物5 μL，10 g/L琼脂糖电泳，电泳结果显示（Fig 1），PCR扩增产物约为529 bp的片段. 将PCR扩增产物克隆于pGEM Teasy中，挑选经酶切鉴定正确的克隆，经正反向全自动序列分析，所得序列结果与GenBank公布的序列完全相同.
2．2Rv2450基因表达载体的鉴定将纯化的重组质粒pGEM Teasy用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，回收529 bp产物，与用相同酶切的pProEX HT质粒连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，然后在选择平板上随机挑选3个克隆，提取质粒用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，有2个克隆切出529 bp的片段，将1号阳性克隆命名为pProEX HT2450（Fig 2）.
2．4表达蛋白的亲和层析纯化从重组菌中制备的包涵体经洗涤后，用8 mol/L尿素变性，上到NiNTA金属鳌合亲和层析柱上，由于pProEX HT质粒多克隆酶切位点上游插入编码6个连续组氨酸残基的序列（6×His tag），在重组质粒进行诱导表达时，6×His tag与外源插入片段共同表达，因而融合蛋白带有6×His tag，后者可与金属镍发生鳌合，从而使目的蛋白在流经柱床时被特异性吸附，再利用咪唑置换，洗脱下特异性结合的蛋白. 120 g/L SDSPAGE证明了这种方法的有效性（Fig 6），经薄层扫描分析融合蛋白纯度可达90%以上. 将分步收集液中含目的蛋白的各管合并，缓慢、逐步降低透析液中尿素的浓度，使变性的蛋白在此过程中自然复性，复性后的目的蛋白经冻干保存，以便于进一步的研究工作.
3讨论
Micrococcus luteus可分泌一种复活促进因子（resuscitationpromoting factor， Rpf）以刺激该菌休眠体复活和生长，促进繁殖体生长，与真核细胞的细胞因子相似，具有自我刺激作用，所以又称细菌因子. 该因子也可以刺激其他种类的高G+C%革兰阳性菌，包括Mtb［3］. Mtb全基因序列分析表明，其中Rv2450c，Rv0867c，Rv1009，Rv2389c和Rv1884c基因与Micrococcus luteus菌Rpf基因同源，其中4个基因编码的蛋白是分泌蛋白，推测结核杆菌这些基因编码的蛋白可能也具有Rpf作用，但尚无直接证据［4］. 巨噬细胞内Mtb的分离培养时发现，巨噬细胞内Mtb由于菌体受到损伤或处于休眠状态，而在体外生长困难，所测的单位体积内细菌形成单位明显低于实际细菌密度，当加入Micrococcus luteus菌的Rpf后，可促进受损伤菌体或处于休眠状态的菌体复苏和生长，生长数量明显增加，敏感度增高［5］. 对Mtb的Rpf样蛋白家族功能研究将有助于结核病复发感染的控制，还可以探讨Rpf样蛋白在体外刺激Mtb的复苏和生长作用，使用Rpf建立Mtb快速、敏感的培养方法，改进临床检验上常规结核杆菌的分离培养和药物敏感实验方法，缩短所需时间，提高检验的敏感度；同时我们还可以探讨Rpf样蛋白可否刺激机体产生相对应的中和抗体，阻断Rpf样蛋白对Mtb的作用，是否可以做为预防和治疗Mtb感染的疫苗. 我们利用融合表达载体pProEX HT表达了氨基端带有6个组氨酸残基的Rv2450，该蛋白以包涵体的形式存在，在变性条件下，利用金属鳌合亲和层析对目的蛋白进行了纯化，并利用缓慢透析的方法使部分目的蛋白得到了复性.
参考文献
［1］ Vladimir V， Yeremee V， Tatiana K， et al. Protein of the Rpf family: Immune cell reactivity and vaccination efficacy against tuberculosis in mice ［J］. Infect Immun， 2003;71(8):4789-4794.
［2］ 杨敏，刘新平，韩炯，等. 乙型肝炎病毒Pres基因的克隆表达及亲和层析纯化［J］. 第四军医大学学报，2001；22（16）：1493-1496.
Yang M， Liu XP， Han J， et al. Cloning and fusion expression of HBVPres gene and its purification using affinity chromatography［J］. J Fourth Mil Med Univ， 2001;22(6):1493-1496.
［3］ Martin CG， Nicholas HK， Angharad PD， et al. Resuscitationpromoting factors possess a lysozymelike domain［J］. Trends Biochem sci， 2004;29(1):7-10.
［4］ Mukamolova GV， Obolbek AT， Konstantir K， et al. The Rpf gene of micrococcus luteus encodes an essential secreted growth factor［J］. Mol Microbiol， 2002;46(3):611-621.
［5］ Adrie JC， Edsmond MC， Mary KH， et al. Mycobacterium tuberculosis WhiB3 interacts with RpoV to affect host survival but is dispensable for in vivo growth［J］. PNAS， 2002;99(5):3147-3152.