关于MPT64 DNA疫苗对鼠结核分枝杆菌感染的保护作用

　　　　　　　　作者：孙平，骆旭东，朱道银，唐国建

【关键词】 结核分枝杆菌
　　【Abstract】 AIM: To explore the protective efficacy of the DNA vaccine encoding Mycobacterium tuberculosis MPT64 in mice infected with Mtb. METHODS: C57BL/6 mice were intramuscularly immunized with the DNA vaccines or BCG (i.d.). The mice were challenged with 106 CFU H37Rv via lateral tail vein 35 d after the third immunization for DNA vaccine groups and 100 d after for BCG vaccinated group. The mice in the vaccinated groups and control groups were sacrificed 42 d after challenge. The lungs and spleens were removed respectively and the number of CFU in organs and histopathologic changes were determined. The antibody level， IFNγ， IL4 and the survival time in all of the mice were evaluated. RESULTS: The antibody titer of pcDNA/MPT64 group was higher than that of other groups (P&<0.05). Both the level of IFNγ produced by spleen lymphocytes and the spleen lymphocyte proliferation from BCG group and pcDNA/MPT64 group were higher than those of other groups (P&<0.05)， and no IL4 was found in all groups. The number of bacterial colonies in the lungs and spleens significantly decreased at 6th week postchallenge in all the vaccinated groups (P&<0.05)， especially in BCG group (P&<0.01). The pulmonary histopathological changes were observed 6 weeks following challenge with M.tuberculosis H37Rv. In PBS and pcDNA3.1 groups， the lesion was characterized by seroplastic inflammatory infiltration and lung tissue necrosis， and in BCG group by granulomas and numerous macrophages， lymphocytes and a few epithelioid cells. The lesion in pcDNA/MPT64 groups was characterized by seroplastic inflammatory infiltration and a few macrophages. The results in spleen were similar to those in lungs. The survival time of BCG vaccinated mice after challenge with M.tuberculosis H37Rv was longer than that of other groups. The survival time of pcDNA/MPT64 group was longer than that of negative control groups. CONCLUSION: The pcDNA/MPT64 can improve the protective efficacy of immunized mice against M.tuberculosis challenge.
　　【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis; MPT64; DNA vaccine
　　【摘要】 目的： 研究MPT64 DNA疫苗对鼠结核杆菌感染的免疫保护效果. 方法： C57BL/6小鼠36只，随机分为4 组. A组（PBS）、B组（pcDNA3.1）、C组（BCG）、D组（pcDNA/MPT64）；分别于胫前肌注射质粒DNA免疫，70 μg/次， 1次/2 wk，共3次. 末次免疫后5 wk用106 CFU H37Rv经尾静脉攻击，攻击后6 wk处死小鼠，测血清总IgG，特异性脾淋巴细胞增殖实验、IFNγ及IL4分泌水平. 作脾、肺组织荷菌量和病理学检查以及观察小鼠存活时间. 结果：MPT64基因疫苗诱导小鼠特异性IgG的产生、脾淋巴细胞增殖以及IFNγ的分泌. MPT64 DNA免疫组肺、脾组织荷菌量，病理学改变和小鼠存活时间明显优于阴性对照组. 结论：MPT64 DNA疫苗在抗结核分枝杆菌(Mtb)感染过程中具有一定免疫保护作用.
　　【关键词】 结核分枝杆菌； MPT64； DNA疫苗
　　0引言
　　DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的一种崭新的免疫接种技术，是继减毒活疫苗、亚单位疫苗之后的第3代疫苗，具有免疫效果良好、尤其是能诱导CTL的形成和性质稳定、生产简便、价格低廉等优点而倍受青睐［1，2］. MPT64是结核分枝杆菌(Mtb)早期分泌蛋白中免疫保护作用比较确切的抗原成分之一，我们在已经构建MPT64真核表达质粒并证实能在小鼠体内诱导特异性体液和细胞免疫应答的基础上，进一步研究其在小鼠体内抗Mtb感染的能力.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　Mtb H37Rv标准株(中科院微生物菌种保藏中心)； pcDNA3.1+，pcDNA/MPT64和E.coli DH5α由本教研室收藏; Endo free质粒抽提试剂盒(Qaigen公司)； IFNγ ELISA试剂盒(上海森雄生物公司); 冻干皮内注射用卡介苗（BCG）、PPD标准品(成都市生物制品研究所). SPF级雌性C57BL/6健康小鼠36只，6~8 wk，体质量18~22 g(重庆医科大学实验动物中心).
　　1.2方法
　　按说明书抽提质粒DNA，紫外分光光度计定量. 动物随机分为4 组，每组9只. A组（PBS， 100 μL）、B组（pcDNA3.1， 70 μg）、C组（BCG）、D组（pcDNA/MPT64， 70 μg）；分别于胫前肌注射75 g/L利多卡因和质粒混合物（1∶4，100 μL）. 间隔2 wk免疫1次，共3次. C组于每只小鼠胸壁皮内注射0.3 mL（相当于0.1 mg），含活菌1×106 CFU. 将经过小鼠体内毒力复苏的H37Rv转种于改良罗氏培养基上， 37℃保湿培养2 wk；自罗氏培养基上刮取生长良好的干菌落用体积分数为0.0005的吐温生理盐水研磨成3 mL的菌悬液，每0.3 mL菌悬液含M.H37Rv 1×106 CFU活菌1 mg. 攻击时间为BCG接种后100 d和末次质粒DNA免疫后5 wk，于每只小鼠尾静脉注射0.3 mL菌悬液，实施攻击；攻击后6 wk各组处死5只小鼠，测外周血总IgG，作PPD特异性脾淋巴细胞增殖实验，测量IFNγ，IL4分泌水平，取肺、脾作荷菌量测定和病理学检查等；余下的4只小鼠用来观察其自然存活时间(采用T50法， Scand J Immunol， 1992;36:307).
　　1.2.1肺、脾荷菌量及病理学检测无菌手术取左全肺，称取一定量的左肺组织加入经过灭菌的5 mL组织匀浆器中，加2 mL灭菌生理盐水，研磨成匀浆；用40 mL/L硫酸2 mL中和，摇匀后静置15 min，以此原液作10倍梯度稀释；选取3个稀释度的悬液100 μL，分别涂布于3个经过37℃复温的改良罗氏培养基上（含BCG抑制剂2thiophenecarboxylic acid hydrazide 2 mg/L），37℃保湿培养4 wk，进行菌落计数，计算每1 g肺组织的荷菌量. 脾组织荷菌量检测同肺组织. 肺、脾病理学检测：取右上肺叶和部分脾组织用40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，分别行抗酸染色和HE染色.

　1.2.2免疫学评价① ELISA法检测血清特异性抗体. PPD标准品100 μL/孔（10 mg/L）包被酶标板，4℃过夜. 1 g/L牛血清白蛋白封闭30 min，洗涤后加入不同稀释度的待检血清，二抗为HRP酶标羊抗鼠IgG，DAB显色，波长490 nm测吸光度（A）值. 以正常鼠血清作阴性对照，A值0.05以上、A实验组/A对照组≥2.1为阳性. ②特异性淋巴细胞增殖实验. 分别分离各组小鼠的脾淋巴细胞，用含10 g/L FCS的RPMI 1640调整细胞密度为2×107/L，活细胞数为90%以上，200 μL/孔加入96孔细胞培养板中，实验组每孔加入5 μL PPD，对照孔不加PPD，调零孔不加淋巴细胞；37℃ 50 mL/L CO2孵箱培养68 h后，每孔加入20 μL MTT（5 g/L溶于PBS，pH 7.2），继续培养4 h后终止培养，1000 r/min离心10 min，吸弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，测A570 nm值，结果用刺激指数（stimulation index，SI）=A实验组/A对照组表示. ③IFNγ的诱导和测定. 用含10 g/L FCS的RPMI 1640调整细胞密度为5×107/L，200 μL/孔加入96孔细胞培养板中，同时每孔加入5 μL PPD，37℃ 50 mL/L CO2孵箱培养72 h后，每组5个孔的培养液混合，5000 r/min离心5 min，取上清-20℃冻存备检. IFNγ的含量的检测用ELISA的方法，以IFNγ的标准品作标准曲线计算IFNγ的含量.
　　统计学处理: 所有计量资料用x±s表示. 采用SPSS软件包进行处理，方差不齐时应用秩和检验.
　　2结果
　　2.1免疫小鼠血清抗PPD IgGMtb尾静脉攻击后6 wk pcDNA/MPT64组抗PPD抗体滴度明显高于其余各组（P&<0.01， Tab 1）， BCG组抗体滴度增幅不大.表1小鼠血清抗PPD抗体、脾淋巴细胞增殖和IFNγ分泌（略）
　　2.2免疫小鼠脾淋巴细胞增殖BCG和pcDNA/MPT64免疫组小鼠脾淋巴细胞在体外经PPD刺激后，可引起淋巴细胞显著的增殖反应，其SI超过PBS组2倍以上；空质粒免疫组小鼠淋巴细胞增殖不明显，SI低于1.3(Tab 1). BCG组与pcDNA/MPT64组间差异有显著性（P&<0.01）.
　　2.3免疫小鼠脾淋巴细胞特异性IFNγ分泌PBS和空质粒免疫组小鼠IFNγ分泌不明显. BCG组与pcDNA/MPT64组间差异显著(P&<0.01， Tab 1)； pcDNA/MPT64和PBS、空质粒免疫组组间差异显著（P&<0.05， Tab 1）.
　　2.4 免疫小鼠肺、脾组织荷菌量BCG组和MPT64 DNA疫苗组明显低于对照组（P&<0.01）， BCG组低于MPT64 DNA疫苗组（P&<0.05， Tab 2）.表2DNA疫苗对鼠结核分枝杆菌感染的保护效果（略）
　　2.5免疫小鼠肺组织病理Mtb尾静脉攻击后6 wk小鼠肺组织切片抗酸染色PBS对照组(Fig 1A)：Mtb呈多片簇状分布，数目众多. BCG组(Fig 1B)：Mtb呈零星分布，数目较PBS和pcDNA3.1+组(Fig 1C)明显减少. pcDNA/MPT64组(Fig 1D)：Mtb呈小簇状和散在分布，数目较PBS和pcDNA3.1+组明显减少，但比BCG组为多. Mtb感染后6 wk小鼠肺组织HE染色镜下病理改变：PBS和pcDNA3.1+组：肺组织充血、实变，部分肺泡结构消失，可见数量不等的浆液纤维素性渗出液、少量淋巴细胞和巨噬细胞浸润以及明显的坏死灶，未见结核肉芽肿形成. pcDNA3.1+组病变程度比PBS组稍轻. BCG组：肺少量充血，渗出比B组轻；肺泡壁轻度肿胀、增厚，可见由上皮样细胞、多核巨细胞和少量淋巴细胞组成的结核肉芽肿，未见坏死灶. pcDNA/MPT64组：可见数量不等的浆液纤维素性渗出液及少量淋巴细胞和巨噬细胞浸润，结核性肉芽的形成不明显.
　　2.6动物存活时间观察200 d各组小鼠50%死亡的平均时间. BCG组无1例死亡，PBS和空质粒组的平均存活时间分别为59 d和75 d，MPT64 DNA疫苗的平均存活时间为95 d.
　　3讨论
　　目前，结核病仍然是严重威胁人类健康的主要传染病之一. 由于BCG的免疫效果不稳定，寻找一种比BCG更有效的抗Mtb感染的疫苗已经成为当务之急. MPT64是Mtb的早期培养液蛋白成分之一，Mr 23 000，由mpt64基因编码，ORF为687 bp. MPT64仅存在于Mtb的H37Rv， H37Ra， Erdman及BCG的一些亚株如Tokyo， Moreau， Russian株之中， 而BCG 的其他亚株Glaxo， Pasteur， Canadian， Tice， Danish 1331和麻风分枝杆菌则缺乏该基因. MPT64是重要的T细胞抗原，主要诱导特异性CTL的形成和IFNγ的分泌，也能诱导体液免疫［3，4］. 在本实验中H37Rv攻击后6 wk，免疫小鼠的PPD特异性抗体较对照组均有不同程度的增加，以pcDNA/MPT64组最高， BCG组次之. PPD特异性脾淋巴细胞增殖应答和IFNγ分泌水平，BCG组和pcDNA/MPT64组显著升高，说明pcDNA/MPT64 DNA疫苗和BCG一样在小鼠体内诱导了免疫记忆，当再次遇到相同抗原刺激时便激活了更为强烈的细胞和体液免
　　
　　从肺脾器官荷菌量，组织病理改变和动物存活时间来看，阴性对照组（PBS和pcDNA 3.1）菌落计数（CFU和抗酸染色）都较高，肺组织主要病理改变为大量的浆液纤维素性渗出、极少的炎症细胞浸润和不同程度的灶性坏死，动物存活时间最短；脾组织病理表现不典型，多为淋巴细胞增生和组织细胞浸润. 阳性对照组（BCG）荷菌量较低，肺、脾组织都可见到大量的淋巴细胞增生、组织细胞浸润，肺组织还可看到大量类上皮细胞的聚集和结核肉芽肿的形成. pcDNA/MPT64 DNA免疫组荷菌量也较其PBS和空质粒组明显减低，但是增生性改变没有BCG组明显. 以上结果提示，MPT64 DNA疫苗对鼠Mtb感染有明显的保护作用，MPT64可作为结核病新型疫苗的候选抗原之一.
　　

参考文献

　　［1］ Doherty TM， Andersen P. Tuberculosis vaccines: Developmental work and the future［J］. Curr Opin Pulm Med， 2000; 6(3): 203-208.
　　［2］ Enserink M. Driving a stake into resurgent TB［J］. Science， 2001; 293(5528): 234-235.
　　［3］ Kamath AT， Feng CG， Macdonald M， et al. Differential protective efficacy of DNA vaccines expressing secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis［J］. Infect Immun， 1999; 67:1702-1707.
　　［4］ Delogu G， Howard A， Collins FM， et al. DNA Vaccination against tuberculosis: Expression of a ubiquitinconjugated tuberculosis protein enhances antimycobacterial Immunity ［J］. Infect Immun， 2000; 68(6): 3097-3102.