作者：曲群， 彭慧霞，宗璐，赵玲，段钊， 杜稳侠
【关键词】 子宫内膜肿瘤
【Abstract】 AIM: To investigate and prepare antiCD3 and antiCyclinD1 BsAb and to discuss the feasibility of treating the cervical cancer with active immunity. METHODS: The mAb of antiCD3 and anti CyclinD1 were crosslinked to be the bispecific monoclonal antibodies (BsAb)， which induced the killing effects on the cells of endometrial carcinoma. RESULTS: The killing rate of the bispecific monoclonal antibody induced effect cells to target cells was 61.23%， which was higher than that of the antiCD3 (42.15%)（P&<0. 01）. This killing rate enhanced along with the elevation of efecttarget radio (78.96%). CONCLUSION: The bispecific monoclonal antibody， crosslinked by BsAb of antiCD3 and antiCyclinD1 has the clinical feasibility of treating the endometrial carcinoma with active immunity.
【Keywords】 endometrial neoplasms; anti gens， CD3; antiboolies， monoclonal; anti CyclinD1; antibodies， bispecific
【摘要】 目的： 制备抗CD3/抗CyclinD1双功能抗体，探讨子宫内膜癌主动免疫治疗的可行性. 方法： 以化学交联方法将抗CD3单克隆抗体与抗CyclinD1 单克隆抗体交联为双功能抗体，进行介导对子宫内膜癌细胞的杀伤作用. 结果：该双功能抗体介导效应细胞对靶细胞的杀伤率为61.23 %，高于单抗CD3 (42.15%)的介导作用（P&<0.01），并随着效靶比的提高杀伤率也升高（78.96%）. 结论： 采用化学交联法制备的抗CD3/抗CyclinD1双功能抗体具有主动免疫治疗宫颈癌的临床可行性.
【关键词】 子宫内膜肿瘤；抗原，CD3；抗体，单克隆；抗CyclinD1，抗体，双特异性
0引言
肿瘤生物治疗是目前研究的热点，研制特异性高效免疫制剂是生物治疗的关键. 双功能抗体具有导向抑制肿瘤细胞生长的活性，可以同时结合靶细胞（肿瘤细胞）和效应细胞（淋巴细胞），在两者之间架起桥梁，增加对肿瘤细胞的杀伤活性. T细胞是人体内最重要的一类免疫细胞，基于激活T细胞来选择性杀伤肿瘤细胞的抗CD3/抗肿瘤的双功能抗体的研制在目前最为常见，在临床上具有较好的应用前景［1］. 我们以化学方法制备抗CD3/抗CyclinD1双功能抗体，，探讨其在子宫内膜癌免疫治疗中的可行性.
1材料和方法
1.1材料
RPMI1640为Gibco/BRL公司产品，二巯基苏糖醇（DTT）、N琥珀亚胺3(2 吡啶二硫基) 丙酸盐 (SPDP)、 小牛血清为均为美国Sigma公司产品，MTT为Promega公司产品，DMSO为西安化学试剂厂产品. 鼠抗CyclinD1单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，抗CD3单克隆抗体购于北京中山生物工程公司. 子宫内膜癌细胞株HEC1A本室冻存. 靶细胞HEC1A细胞，在37℃ 50 mL/L CO2条件下，培养于含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养基中，约2～3 d传代1次，保持细胞在对数生长期. 人外周血淋巴细胞（PBLS）来自健康献血者.
1.2方法
1.2.1双特异性抗体(BsAb)制备按文献 ［2］方法进行，略加改进. 将纯化的抗CyclinD1单抗和抗CD3单抗各1 g/L，在4℃下，pH 7.5 PBS透析过夜，用无水乙醇将SPDP完全溶解，取SPDP按8倍的体积比，分别加入浓度均为0.5 g/L的CyclinD1单抗和抗CD3单抗的透析袋中，轻轻混匀，置室温下反应30 min， 4℃下分别以0.1 mol/L pH 4.5醋酸盐缓冲和0.1 mol/L pH 7.5磷酸盐缓冲透析，每3 h换透析液1次，共3次，将抗CyclinD1单抗和抗CD3单抗混合，加入终浓度为50 mmol/L的DTT，摇匀25℃反应30 min，再于4℃下对PBS透析过夜，间隔4 h换透析液1次，共4次， 转入离心管内离心10 min (8000 r/min)， 收集上清，紫外分光光度计下测量蛋白浓度，用0.23 μm的滤膜过滤除菌备用.
1.2.2BsAb对淋巴细胞增殖活性的影响分离外周血淋巴细胞，调整至细胞数2×108/L，于96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，分别加入各种相应抗体，总体积200 μL，各做3个平行样，将加好样的96孔板于50 mL/L CO2培养箱中37℃培养72 h，每个样孔加入5 μL［3H］TdR(1.85×104 Bq)，37℃继续培养16 h. 用多头细胞收集器收集各孔细胞悬液至玻璃纤维滤纸上，42℃烘干，每孔收集物浸入2 mL闪烁液，液闪计数.
1.2.3细胞毒试验采用MTT法［3］. 活细胞，特别是增殖期的细胞可通过线粒体代谢过程中的琥珀酸脱氢酶的作用，使淡黄色的四甲基偶氮唑盐（MTT）还原为蓝紫色结晶. 结晶的形成量与活细胞数呈正相关. MTT法可间接测定CTL细胞对靶细胞的杀伤能力. 以HEC1A细胞作为靶细胞，CTL细胞作为效应细胞. 效应细胞与靶细胞的比例为40∶1， 80∶1. 将两者混合后放于37℃ 50 mL/L CO2孵箱中16 h，加入MTT作用4 h，以 DMSO 显色，振荡10 min，酶联检测仪测A570 nm值. 对靶细胞的杀伤百分率＝(靶细胞对照孔A值-实验孔A值)/靶细胞对照孔A值×100％
统计学处理： 采用单因素方差分析，所有数据均经SPSS10.0统计软件处理.
2结果
2.1不同抗体对淋巴细胞增殖活性的影响BsAb组和抗CD3组对淋巴细胞增殖均有促进作用，但抗CD3单抗对淋巴细胞增值作用更明显. 两组与抗CyclinD1单抗及对照组相比均有显著差异(P&<0. 01， Tab 1）.
表13种抗体对淋巴细胞增殖活性的影响 （略）
2.2BsAb介导免疫活性细胞对子宫内膜癌细胞的杀伤效应当效靶比为80∶1时，淋巴细胞在不同抗体作用下对癌细胞毒性作用较40∶1时明显增强；BsAb与抗CyclinD1和CD3单抗相比均有显著差异(P&<0. 01， P&<0.05， Tab 2).表2BsAb介导免疫活性细胞对子宫内膜癌细胞的杀伤效应（略）
子宫内膜癌发病率在我国妇科恶性肿瘤中居第2位［4］，手术后复发患者是子宫内膜癌治疗中的棘手问题. 若采取手术，放疗并辅助以生物治疗，可能会有更好的治疗效果. 细胞周期调节失控，是肿瘤发生的重要机制. 近年研究认为，细胞周期素D1( CyclinD1)基因参与肿瘤的发生、发展，CyclinD1 基因扩增和高表达能导致细胞调控机制平衡紊乱和细胞增生失控［5］. 人类CyclinD1基因定位于11号染色体上，有292个氨基酸组成，在哺乳动物正常细胞G1/S期转变的起始阶段起着重要作用，已成为比较肯定的原癌基因［6］. 众多实验表明CyclinD1在子宫内膜癌中高表达［7，8］. 推测CyclinD1是子宫内膜癌的肿瘤基因蛋白，并且具有抗原的理化特性. 由于大多数肿瘤的抗原呈机制缺陷，以及肿瘤抗原的个体差异和弱免疫原性，加之肿瘤的抗原调变，很难做到用特异性抗原肽刺激T细胞活化，以治疗肿瘤. T细胞是人体内主要免疫活性细胞，抗CD3单抗能激活T淋巴细胞，使杀伤性T细胞IL2受体表达增多，刺激CTL对肿瘤细胞发挥细胞毒作用，而对正常细胞安全无毒，从而使T细胞分裂增殖及细胞毒性增强. 应用针对特异肿瘤抗原的单克隆抗体对肿瘤进行治疗是肿瘤免疫疗法的重要组成部分，尽管单抗的针对性强，半衰期也长且能介导CDC及ADCC作用，但很难穿透肿瘤发挥杀伤作用. 双功能抗体其作用机制在于以双特异性抗体作为连接桥，将肿瘤细胞和免疫效应细胞连接在一起，使免疫效应细胞能导向性地、更有效地杀伤肿瘤细胞. 双功能抗体将单克隆抗体的高度特异性和细胞毒细胞杀伤效应结合起来，提高了细胞毒细胞的特异性杀伤作用［9］. 我们采用化学方法成功得到抗CD3/抗CyclinD1双功能抗体，此抗体对淋巴细胞有较强的增殖活性，并能显著提高对癌细胞的杀伤作用，其介导效应细胞对靶细胞的杀伤率高于抗ＣＤ3单抗的介导作用，并随着效靶比的提高而升高. 提示所制备的抗CD3/抗CyclinD1双功能抗体同时具有效应性和特异性导向肿瘤细胞的的双重功能，既可与子宫内膜癌细胞（靶细胞）结合，又可与激活效应细胞（淋巴细胞）结合，激活效应细胞，最终表现为肿瘤坏死和生长抑制.
我们应用化学方法，制备抗CD3/抗CyclinD1双功能抗体，具有制备周期短、易于分离等特点，并具有使效应细胞靶向杀伤肿瘤细胞的可能性. 本实验为进一步的研究打下了基础.
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