作者：杨志福，周四元，杨铁虹，梅其炳，刘莉
【关键词】 高效液相色谱
【Abstract】 AIM: To set up a sensitive and rapid high performance liquid chromatography (HPLC) method to determine MN9202 and to study its pharmacokinetics in Beagle dogs. METHODS: The mobile phase and extraction methods were optimized by the orthogonal experimental design. MN9202 was intravenously administered to the Beagle dogs at the dose of 0.335 mg/kg and MN9202 in plasma was detected by HPLC. The pharmacokinetic parameters were calculated by 3P97 software. RESULTS: Under the selected HPLC conditions， the MN9202 was clearly separated from interference and the retention time of MN9202 was less than 14 min. When MN9202 was intravenously administered， the plasma concentrationtime curve was fit to twocompartment model. T1/2β was （200±32） min. and AUC was （32 147±9544）μg・min/L. CONCLUSION: The analytical method we set up is simple， sensitive and accurate， and it can be applied to determine the MN9202 in the plasma of Beagle dogs. The speed of elimination of MN9202 is high in Beagle dogs.
【Keywords】 MN9202; pharmacokinetics; HPLC; halflife; orthogonal test
【摘要】 目的：建立高效液相色谱法测定Beagle犬血浆中1，4二氢2，6二甲基4（3’硝基苯基）3，5吡啶二甲酸甲戊酯（MN9202）的方法，并研究其代谢动力学规律. 方法： 采用正交设计优化色谱分离条件. Beagle犬给予二氢吡啶类药物MN9202 (0.335 mg/kg，iv)，用反相高效液相色谱法分析血浆中原型药物浓度，血浆药物浓度时间数据用3P97药代动力学软件分析. 结果：在选定的色谱条件下，MN9202和干扰能得到较好的分离，其保留时间&<14 min. Beagle犬静脉注射给予MN9202后，其体内过程符合二室模型，T1/2β为（200±32 ）min，曲线下面积（AUC）为（32 147±9544）μg・min/L. 结论: 所建立的方法稳定、简便、准确，可用于Beagle犬血浆中MN9202的浓度测定. MN9202在Beagle犬体内代谢迅速.
【关键词】 MN9202；药物代谢动力学；高效液相色谱；半衰期；正交试验
0引言
1，4二氢2，6二甲基4（3’硝基苯基）3，5吡啶二甲酸甲戊酯（MN9202）是一种二氢吡啶类钙通道阻滞剂，对角叉菜胶诱导的大鼠尾动脉血栓形成有很好的保护作用［1］，而且可能通过阻止5HT的合成或(和)减少5HT的释放或影响5HT受体，从而影响心肌肥厚的发生发展［2］.但对MN9202药代动力学的研究还未见报道. 我们建立Beagle犬血浆中MN9202的高效液相色谱检测方法，观察静脉给予MN9202后，药物在Beagle犬体内的消除动力学，可望为其临床前研究提供依据.
1材料和方法
1.1材料
Beagle犬5只，体质量（9±2） kg，由国家医药管理局新药研究管理中心成都实验动物基地提供(质量合格证号：四川实验动物管理质量合格证第63号). 高效液相色谱仪(美国Beckman公司)，LD52A型离心机（北京医用离心机厂）. 色谱分析柱为C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，phenomenex)，流动相组成为乙腈及水(82∶18，V/V)， 流速1 mL/ min. 检测波长为350 nm. MN9202和MN9203（内标）为本教研室合成，纯度&>98%. 用乙醇二甲基亚砜聚乙二醇400生理盐水（10∶10∶30∶50=V∶V∶V∶V）配置成0.875 g/L的注射液，避光保存. 乙腈（色谱纯，TEDIA公司），碱化液为50 mmol/L磷酸氢二钠溶液（用氢氧化钠调节pH至12），其他试剂均为分析纯.
1.2方法
精取犬血浆0.5 mL，加入内标溶液（MN9203 5.00 mg/L） 0.05 mL，混匀，加入碱化液1 mL，混匀后，再加入乙醚1 mL，涡流震荡1 min，离心5 min（4000 r/min），分取上层有机相，用乙醚提取2次，合并提取液于尖底试管中，通风橱中挥干. 残留物用50 μL甲醇溶解，取20 μL用于高效液相色谱分析. Beagle犬5只实验前12 h禁食，自由饮水. MN9202按0.335 mg/kg静脉注射给于Beagle犬，分别于给药后0，5，10，20，40，60，120，180，240，300和360 min犬前腿部静脉采集血液标本，肝素抗凝，离心后得血浆样品，备用.
统计学处理: 数据以x±s表示，采用3P97药代动力学软件（中国科学院北京数学研究所研制）拟合药时曲线，选择模型.
2结果
2.1方法的专属性色谱分离良好，MN9202检测不受内源性杂质峰干扰(Fig 1)，MN9202的保留时间为7.5 min， 内标MN9203的保留时间为12.2 min.
2.2标准曲线取8支试管分别加入犬空白血浆0.5 mL，然后分别加入不同浓度的MN9202标准液0.05 mL，使其终浓度为15， 50， 100， 200和500 μg/L（内标浓度为200 μg/L），按上述正交设计中血浆样品处理项下操作. 以血浆中MN9202浓度(ρ)为横坐标，MN9202与内标物MN9203的峰面积之比（Y）为纵坐标，Y=0.00555ρ-0.02396 （r=0.9999，n=8），线性范围为15～500 μg/L.
2.4精密度分别于0.5 mL的空白血浆中加入低、中、高3种不同浓度的MN9202溶液（含内标），混匀，得到15，200和500 μg/L不同浓度的血浆样品，按上述正交设计中血浆样品处理项下操作. 然后在1 d内不同时间进样，测得3种浓度标准血浆的日内精密度（RSD）分别为14.1%， 4.6%和3.7%（n=8）；相同浓度的标准血浆在8 d内的日间RSD分别为11.3%， 6.2%和9.2%（n=8）.
2.5最低检测限分别制备浓度为8， 10和15 μg/L MN9202的血浆样品，每个血样平行做8份，按上述方法处理，取以测定结果的RSD达到≤20％和准确度（平均浓度偏离配置浓度）达到≤20％时，样品中药物的最低浓度为最低检测浓度，结果为15 μg/L.
2.6Beagle犬体内药代动力学不同时间点的血浆样品，按上述正交设计中血浆样品处理项下操作，测定其浓度(Fig 2). 采用3P97药代动力学软件（中国科学院北京数学研究所研制）进行拟合，药时曲线符合二室模型，得药代动力学参数(Tab 1).表1Beagle犬MN9202 0.335 mg/kg静脉注射后药代动力学参数（略）
3讨论
我们采用正交设计对血浆中MN9202的提取方法和色谱条件进行优化，最佳流动相配比为乙腈：水=84∶16（V/V），但在此流动相配比下色谱基线不稳，峰积分面积误差较大，因此选择流动相配比为乙腈：水=82∶18（V/V）. 由于二氢吡啶类药物在237 nm和350 nm存在双吸收现象，在筛选中发现237 nm处测定内源性物质干扰特别强，所以选择350 nm测定. 建立的测定血浆中MN9202的RPHPLC方法，经回收率、精密度及工作曲线考察，表明此检测分析方法具有灵敏、准确、迅速的特点，符合药代动力学研究的基本条件. 由于二氢吡啶类药物的不稳定性，反复冻融有可能对样品和内标产生影响，所以本研究所检测的均为新鲜血样.
MN9202为间硝苯地平（mnifedipine）同系物，对一系列间硝苯地平同系物的药效学研究表明，此类药物随着5位酯基碳原子数目的增加其降压活性亦随之增强，但是对其药代动力学缺乏系统研究. Beagle犬静脉注射间硝苯地平，其体内过程符合二室模型，T1/2β为116.8 min［3］； Beagle犬静脉注射 MN9202后，在体内代谢也符合二室模型，T1/2β为（200±32 ）min. 上述结果提示：①间硝苯地平同系物静脉给药后，在一定范围内，随着间硝苯地平同系物C5位酯基碳原子数目的增加药物的消除半衰期逐渐延长；②从药代动力学角度看，MN9202比其他间硝苯地平同系物更具优势，具有明显的开发价值. 由于二氢吡啶类药物临床大多采用口服给药方式，而且生物利用度很低，MN9202口服后在动物体内是否也存在上述现象，还有待进一步探讨.
【参考文献】
［1］ 王莉莉，李志超，梅其炳，等. MN9202保护血栓大鼠尾动脉血管作用［J］. 第四军医大学学报，2000；21(2):214-216.
Wang LL， Li ZC， Mei QB， et al. MN9202 protection of tail artery in carrageenan induced thrombosis rats ［J］. J Fourth Mil Med Univ， 2000;21(2):214-216.
［2］ 王剑波，郭炜，梅其炳，等. 钙拮抗剂MN9202对心肌肥厚大鼠全血和心肌中5HT的影响［J］. 第四军医大学学报，2003；24（18）：1688-1690.
Wang JB， Guo W， Mei QB， et al. Effects of MN9202 on 5HT contents in blood and myocardium in rats with cardiac hypertrophy ［J］. J Fourth Mil Med Univ， 2003;24(18): 1688-1690.
［3］ 杨志福，周四元，杨铁虹，等. 间硝苯地平在Beagle犬体内的药代动力学［J］. 药学学报，2004；39（8）:609-612.转贴于