作者：石向群，杨金升，汪泳，包仕尧
【关键词】 水通道蛋白
【Abstract】 AIM：To examine the distribution of AQP4 in normal rat spinal cord so as to provide theoretical basis for further study on its physiologic function. METHODS: Immunohistochemical staining with antiAQp4 monoclonal antibody was performed on spinal tissue frozen sections from healthy adult SD rats. RESULTS: The positive staining cells mostly included ependymal cells of myelocoele， glial cells， motor neurons， and epithelial cells of spinal pia mater. The staining was mainly located on the cell membrane. Most importantly， it displayed certain directivity in the glial cells， mainly at the membrane side contacting with capillary endothelial cells. CONCLUSION: AQP4 is widely expressed in rat spinal cord. In the glial cells， it is mainly located at the membrane side contacting with capillary endothelial cells， which are associated with bloodbrain barrier， suggesting that AQP4 may be involved in spinal water metabolism.
【Keywords】 Aquaporin4; distribution; rat; spinal cord
【摘要】 目的： 明确正常大鼠脊髓内水通道蛋白4（AQP4）的表达与分布，为进一步研究其生理功能提供理论依据. 方法： 采用AQP4 mAb，对正常SD大鼠脊髓的冰冻切片进行免疫组织化学染色，检测AQP4蛋白的表达水平. 结果： 免疫组织化学染色结果显示阳性着色细胞包括有胶质细胞、中央管室管膜上皮细胞、脊髓前角运动神经元、软脊膜上皮细胞，着色部位主要在细胞膜，其中在胶质细胞表现出一定的方向性，主要分布在与毛细血管内皮细胞接触的一侧. 结论： AQP4在正常大鼠脊髓内具有广泛的表达，在胶质细胞上其表达分布于与血脑屏障相关的毛细血管内皮细胞的一侧. 其表达的解剖分布提示AQP4在脊髓内主要参与中央管内水代谢以及神经组织间的水代谢调节.
【关键词】 水通道蛋白4；分布；大鼠；脊髓
0引言
1988年第一个水通道蛋白（Aquaporin， AQP）被发现，1997年被正式认可命名，从而为极性水分子透过以脂质双分子层为特征的细胞膜提供了分子结构依据［1］. 目前已发现的水通道蛋白有11种，它们广泛分布于各种生命体中，参与介导调节水分子的跨膜转运. 研究发现水通道蛋白功能障碍已成为某些水代谢障碍疾病的中心环节［2］. 脊髓水肿是脊柱、脊髓损伤后的主要并发症之一，而且影响脊髓功能的恢复［3］，但目前尚缺乏对AQP4在脊髓组织中的分布以及生理功能的探讨. 我们采用免疫组织化学探讨AQP4在SD大鼠脊髓内的分布特点，依据结构与功能相一致的原则，推测其在脊髓内可能的生理功能，为脊髓内水代谢的调节和脊髓水肿的防治研究提供理论依据和新的思路.
1材料和方法
1.1材料
健康成年SD大鼠6只，体质量(300±25) g，雌雄各半，由苏州大学实验动物中心提供. AQP4兔抗大鼠mAb购于深圳达科为生物技术公司（美国ADI公司的产品），其抗原决定簇为AQP4 C端的17个氨基酸. 浓缩型抗兔SP免疫组织化学检测试剂盒及DAB浓缩显色液购于华美生物工程公司.
1.2方法
1.2.1标本采集给予大鼠36 g/L水合氯醛5 mL过度麻醉后经心脏快速灌注冰生理盐水300 mL，随后经心脏灌注40 g/L多聚甲醛PBS（pH 7.3）300 mL，先快后慢，灌注固定后经后正中切口、咬除脊突和椎弓根，取颈、胸、腰段脊髓各一小段，将大鼠脊髓置入相同固定液中后固定24 h.
1.2.2冰冻切片取经后固定处理好的大鼠各部分脊髓，长约5 mm，置入200 g/L蔗糖中，至组织块沉底后置入300 g/L蔗糖中过夜，随后经OCT包埋、快速冰冻，恒冷箱切片机切片、片厚18 μm，裱于经防脱片处理的清洁载玻片上，-70℃保存待用于免疫组织化学检测.
1.2.3免疫组织化学检测按免疫组织化学常规步骤进行. 取-70℃冰冻保存的切片，-20℃缓冲30 min后置室温晾干，PBS漂洗2×10 min，滴加20 mL/L h3O2于组织切片上，室温孵育切片10 min；PBS漂洗3×10 min，滴加10 g/L BSA/PBS于切片上，置切片于盛有少量PBS的湿盒内37℃ 20 min；弃去组织切片上的液体，擦干组织切片周围的载玻片，滴加兔抗大鼠AQP4 mAb于组织切片上，置切片于盛有少量PBS的湿盒内，4℃过夜；PBS漂洗3×10 min，每切片滴加约50 μL试剂盒中的生物素化二抗，37℃湿盒中孵育60 min；PBS漂洗3×10 min，每切片滴加约50 μL酶标链亲素，37℃湿盒中孵育30 min；PBS漂洗3×10 min，DAB显色液显色，镜下观察，待显色合适后以PBS清洗终止显色反应. 滴加10 g/L苏木素 复染1 min，流水漂洗5 min，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、树脂胶封片. 光镜观察结果.
脊髓内AQP4阳性细胞见于：脊髓中央管室管膜上皮细胞呈强阳性表达，尤其细胞膜上更加明显（Fig 1）. 脊髓前角运动神经元也有明显阳性着色，同样也是以细胞膜着色为主，其间的胶质细胞也表现阳性着色（Fig 2）. 脊髓白质内的胶质细胞、脊髓表面软脊膜上皮细胞，其中细胞的着色也主要在细胞膜上，以邻近蛛网膜下腔和面向毛细血管内皮细胞的胶质细胞表现得更加突出（Fig 3）. 胶质细胞和中央管室管膜上皮细胞着色具有一定的极性分布现象，前者主要分布于与毛细血管接触的一端，后者主要分布在靠中央管的顶端. 上述分布现象在脊髓不同节段无明显差异.
3讨论
从我们所发现的AQP4在脊髓中的分布情况，结合AQP4在脑内分布的相关文献［4］，可发现AQP4在脊髓中的空间分布特点主要有：① 主要分布于参与脑脊液的形成与吸收的相关结构，中央管室管膜上皮细胞、软脊膜上皮细胞；② 分布于参与血脑屏障形成的相关结构，胶质细胞；③ 分布于对细胞外间隙K+浓度敏感的神经元细胞. 我们发现AQP4在胶质细胞和中央管室管膜上皮细胞上的分布表现出明显的极性现象，即AQP4主要分布于面向毛细血管内皮细胞、软脑膜和中央管室管膜一侧的细胞膜或足突上，以及中央管室管膜上皮细胞的顶端.
已有的研究资料［5，6］显示胶质细胞膜上钾离子通道的分布与AQP4在胶质细胞上的分布很相似，也具有相同的极性分布现象. 复习对K+转运的相关研究结果发现：①胶质细胞在调节维持细胞外间隙K+浓度的恒定扮演着重要作用，因为神经元兴奋将导致细胞外间隙K+浓度的升高，但升高的K+将被主要集中在胶质细胞的足突膜上K+通道所分流；② K+的有效清除对维持神经细胞处于正常功能状态是必不可少的. 但K+的流动必将伴随水分子的流动，以代偿因K+流动所引起的渗透压的变化. 分布于面向毛细血管内皮细胞和软脑、脊膜侧的胶质细胞和前角运动神经元细胞膜上的AQP4在组织解剖分布上与K+通道相一致，由此支持AQP4在功能上参与维持调节细胞外K+、水的代谢的生理功能的推测. 我们发现AQP4在脊髓中央管室管膜上皮细胞的表达水平很高，而且阳性着色主要分布在上皮细胞的顶端，对于这种分布的生理意义，我们做如下推测：分布于脊髓中央管室管膜上皮细胞的AQP4的主要生理功能是参与脊髓中央管脑脊液的形成和重吸收. 因为脑脊液形成的开始时期即由脑脉络丛上皮细胞分泌出相对高渗透压的脑脊液进入脑室，随后通过脑室管膜上皮细胞分泌水分以缓冲脉络丛上皮细胞分泌的高渗透压盐液，达到最终形成等渗的脑脊液［7］. Yamamoto等［8］使用蛋白激酶C活化剂TPA处理培养的胶质细胞，可明显降低AQP4， AQP9基因和蛋白的表达水平，而且发现这一效应可以被蛋白激酶C的抑制剂所逆转，但是蛋白质合成抑制剂并不改变TPA对胶质细胞AQP4的影响. 同时发现上述所有过程中对AQP5均不产生影响. 从这一结果可以推测：①细胞内的信号传导途径上的蛋白激酶C的活性变化可以直接影响细胞AQP4的表达水平及其活性；②不同的AQPs的调节途径可能不同. AQP4在细胞亚结构的定位发生变化时，同样可以导致其生物效应的变化. Kenichi 等［9］的研究结果显示AQP4的C端第276~280的5个氨基酸对于AQP4固定在细胞膜上起着重要作用，它的突变或缺失均将导致AQP4不能正常定位在细胞膜上，从而进一步影响其生物学效应. 类似的研究结果［10］见于肌营养不良小鼠，因肌营养蛋白基因的缺陷导致肌营养蛋白功能缺陷，后者可以影响AQP4在胶质细胞和肌细胞膜上的正确定位，由此进一步影响着AQP4生理功能的发挥. 此外AQP4也会通过蛋白构像的变化而使活性发生改变［11］.
【参考文献】
［1］ 石向群， 王运良， 包仕尧. 水孔蛋白与缺血性脑水肿研究进展［J］. 国外医学脑血管疾病分册， 2001；9（4）：225-226.
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［9］ Kenichi N， Atsuko F， Mamoru N， et al. A role of the Cterminus of aquaporin 4 in rats membrane expression in cultured astrocytes［J］. Genes to Cells， 2002; 7(7): 731-741.
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