作者：陈平，杨耀琴， 陶惠红，杨虎川
【关键词】 电磁场
摘要：目的 探讨不同频率的低功率电磁场对胆囊癌细胞恶性增殖及DNA损伤的作用及其意义。方法 采用绘制细胞生长曲线及单细胞凝胶电泳技术分别检测竟不同频率电磁场作用后，胆囊癌细胞的增殖及DNA损伤情况。结果 经不同频率（0.1～40 MHZ）电磁场作用后，各实验组总体上均可见细胞增殖受到抑制，DNA链产生断裂损伤，统计学检验较正常对照有显著意义。结论0.1～40MHZ范围低功率电磁场对胆囊癌细胞增殖及DNA损伤产生明显影响，主要表现为使DNA链产生断裂损伤，进一步抑制细胞增殖，且这种作用和频率有关，但并不是“线性”关系。
关键词： 频率；电磁场；单细胞凝胶电泳；细胞培养；胆囊肿瘤； DNA损伤
Abstract: Objective To study the effects of low-power electromagnetic fields of different frequencies on proliferation and DNA damage of gallbladder cancer cells. Methods Cell growth curve was drawn and single cell gel electrophoresis performed to evaluate the proliferation and DNA damage of gallbladder cancer cells respectively after the cells were exposed to electromagnetic fields of different frequencies. Results After exposure to low-power electromagnetic fields of different frequencies (0.1-40 MHz)， the cells displayed significant changes with obvious cell proliferation inhibition and DNA strand breakage. Conclusion Low-power electromagnetic fields within the range of 0.1-40 MHz may impair the DNA strand and cause inhibition of proliferation of the gallbladder cancer cells， and these effects are related to the frequency of the electromagnetic fields but not in a linear fashion.
Key words: frequency， electromagnetic field; single cell gel electrophoresis; cell culture; gallbladder cancer; DNA damage
电磁场可分为长波、中波、短波、射频、微波、极低频率电磁场。在一定范围内，微波对较小极性分子作用明显，而波长较长的射频电磁场则对极性大分子有较强影响。电磁场的生物学作用，由于其生物物理机制尚未清楚，因此，它对生物体产生何种影响仍有争议。但就其作用的环节，主要是通过改变细胞内诸如分子三维结构、蛋白质的表达、RNA分子或DNA分子等。其中，细胞DNA的损伤是影响细胞增殖等生物学行为的基础，具有重要的生物学意义[1]。本研究通过绘制细胞生长曲线、单细胞凝胶电泳检测低功率（2 mW/cm2以下）电磁场中，不同频率（主要是射频）对胆囊癌细胞恶性增殖能力及DNA损伤的变化，并对其生物学作用进行初步探讨。
1 材料和方法：
细胞培养与处理 胆囊癌细胞（本实验室建株）常规培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中。取指数增生期细胞经0.25%胰酶消化后，制成细胞悬液，置于连续可调射频发射仪（上海凇航公司提供），按不同频率（0.1、1、20、40 MHZ）分组，作用2 h，电磁场功率均低于2 mW/cm2，并保持作用环境在370C，pH7.2恒定，设未处理组为对照。
1.2 细胞计数、绘制细胞生长曲线 取指数生长期细胞，消化后接种于培养瓶中，培养24 h后，随机分组，并按上述分组条件处理接种后，每日每组取3瓶（每瓶计数4次）计每毫升细胞数，取均值，连续5 d，绘制细胞生长曲线。
1.3 单细胞凝胶电泳实验
1.3.1单细胞凝胶电泳原理 单细胞凝胶电泳（single-cell gel electrophoresis， SCGE）又称彗星试验（comet assay）是一种快速、灵敏、简便的检测DNA损伤的方法，广泛应用于DNA损伤、交联的检测、药物毒性评价、细胞调亡鉴定等工作中，其原理初步认为，各种因素诱发细胞DNA损伤后会影响DNA的高级结构，使其超螺旋松散，这种细胞经过实验中细胞原位裂解、DNA解链等过程后，电泳时，损伤的DNA从核中溢出，朝阳性方向泳动，产生一个尾状带，未损伤的DNA部分保持球形，二者共同形成“彗星”。在一定范围内，“彗星”的长度（代表DNA迁移距离）与DNA损伤程度相关，这样就可以定量检测单个细胞中的DNA损伤[2-4]。
1.3.2 SCGE具体的实验步骤 彗星试验
参考文献
[5]方法，并根据本实验室情况加以改动。300 ul 的含106个/ml的细胞悬液加入600 ul的1％的低溶点琼脂在370C混匀，铺在预冷的载玻片上，放入40C冰箱中5 min；把载玻片置于新配的裂解液细胞中（2.5 mol/L NaCl、100 mmol/L Na2EDTA、10 mmol/LTris-Hcl， pH 10的1%Triton x-100 和10%DMSO在用时加入），于40C裂解1.5 h；将载玻片置于水平电泳槽中，电泳槽内装满新配制的电泳缓冲液（1 mmol/L Na2EDTA、300 mmol/L NaOH ， pH&>13），在电泳缓冲液中保留30 min，以促使DNA解旋和表达不耐碱位点；放在40C冰箱；于20 V、200 mA（通过调整液面高低面获得）下电泳50 min；放在40C冰箱；用0.4mol/L 的Tris-Hcl(PH7.5)洗3 次，每次5 min；每张片子用20 ug/ml EB 染液100 ul染色2～5 min；观察测量并计数；1.4 统计学处理
实验数据以±s表示，样本均数进行方差分析。
2 结果
2.1 细胞生长曲线
胆囊癌细胞经不同磁场电磁场处理后的生长曲线（图1）提示：不同频率电磁场作用后第2、3天，处理组细胞的生长显著低于对照组细胞（P&<0.05），且5组之间只有0.1 MHZ组和1 MHZ组无统计学差异(P&>0.05)，其余各组间均有统计学差异（P&<0.05）；第4天0.1 MHZ组细胞增殖较快，但与对照组之间无统计学差异(P&>0.05)，其余各组之间均有统计学差异（P&<0.05）；第5天对照组细胞增殖较快，5组之间均有统计学差异，其细胞数顺序依次为：对照组&>0.1 MHZ&>20 MHZ&>40 MHZ&>1MHZ。可见经过电磁场处理后，细胞增殖明显降低。电磁场对细胞增殖有明显的抑制作用，但从生长曲线图中可见磁场对细胞增殖的抑制作用并不和磁场成正比，5组中以1MHZ组作用最为明显。
2.2 不同频率电磁场对胆囊癌细胞DNA迁移效应的影响
2.2.1 SCGE图像
胆襄癌细胞经不同频率电磁场作用后，经SCGE和DNA 染色，在荧光显微镜下观察，对照组细胞核DNA呈光滑圆团，平均直径在12.67 um左右，无慧尾形成。不同频率电磁场作用后的细胞DNA链断裂，在电泳作用下，向正极迁移，产生“彗星”一样拖尾（图2）。 图1 胆囊癌细胞经不同频率电磁场处理后的生长曲线（略）
图2胆囊癌细胞不同频率电磁场作用后单细胞凝胶电泳图（略）表1 不同频率电磁场对胆囊癌细胞DNA迁移效应的影响（略）
2.2.2 不同频率电磁对胆囊癌细胞DNA迁移效应的影响 经SCEG和DNA染色，在荧光显微镜下拍照，然后统计有尾细胞数并测定DNA迁移长度(表1)。从0.1MHZ到40MHZ组，细胞迁移比率在24%～32%之间，与对照组之间差异显著性（P&<0.01）。提示不同频率电磁场对胆囊癌细胞DNA链产生断裂损伤。
3 讨论
电磁场生物效应大致可分为两大部分：磁场直接作用和磁场间接作用[6]。现普遍认为磁场间接作用的生物效应是由磁场的感应电场所诱发，而与磁场本身无关，如电磁场的热效应。磁场直接作用也即电磁场的非热生物学效应，是由磁场直接诱发（参量谐振理论）或由磁场与感应电场共同诱发（如离子回旋谐振）[7]，一般低功率电磁场可产生直接作用。本实验采用低功率电磁场对胆囊癌细胞进行作用，且处理过程中温度保持不变，可排除电磁场的间接热效应，而主要为电磁场的直接生物效应。 转贴于 与对照组相比，不同频率电磁场作用后，除第4天0.1MHZ组和对照组之间无统计学意义外，其余各天处理组与对照组之间均有统计学意义，处理组与对照组相比细胞增殖减少，表明了电磁场抑制胆囊癌细胞增殖。目前有关实验报道，电磁场作用存在频率“窗口”效应[8，9]。本实验结果显示，电磁场对胆囊癌细胞增殖和频率有关，但并不是成“正比”关系，通过生长曲线图可见，第5天时，以1MHZ组受到电磁场的抑制作用最为明显，而开始4天以40MHZ组细胞受到电磁场的抑制作用最为明显。
有报导电磁辐射可引起DNA的损伤和染色体畸变，在形态学上表现为微核的形成或细胞凋亡，也有研究发现极低频率电磁场使人鳞状上皮癌细胞系细胞微核形成率及细胞凋亡率在作用后48 h和72 h明显升高，而养水细胞系细胞变化不明显，表明人类的不同细胞系对极低率电磁场的反应是不同的[10]。本实验采用SCGE技术观察了不同频率电磁场对胆囊癌细胞DNA损伤情况，结果证实：电磁场对胆囊癌细胞DNA产生链断裂损伤作用，且和频率有关，但并不和频率成“线性”关系，尽管0.1MHZ和40MHZ组与1MHZ和20MHZ组之间有差异，但差异无统计学意义。在碱性电泳液的作用下，DNA解螺旋，使DNA的断链和碱变性DNA片段从严密的超螺旋结构中释放出来，由于这些DNA断链相对分子质量较小且碱变性为单链，所以在电场中就可以离开核DNA在凝胶分子筛中向阳极移动，形成“彗星”状图像，如果DNA的断链和碱变性片段就越多，断裂也越小，在相同电泳条件下，彗尾迁移长度就越长。本实验“彗星”图像表明，电磁场各组均可引起DNA电泳迁移，形成彗尾明显，且迁移长度和频率有关。
电磁场抑制细胞增殖的可能机制：电磁场对细胞代谢的影响，培养液中的荷电离子在电磁场作用下，其荷电能力发生改变，影响了这些离子的移动速度和排列形式，使细胞代谢所需酶的活性或功能受到干扰，细胞代谢水平降低，细胞的增殖能力降低，这在我们前期研究不同频率电磁影响胆囊癌细胞游离Ca2+浓度中得到证实[1]；电磁场损伤DNA链，影响DNA合成，电磁场的能量直接作用于DNA合成的信使转录系统，降低了DNA的合成速度，使细胞增殖受到抑制[11-13]。另外有文献报道低频电磁场可能是通过改变成骨细胞的细胞周期，从而影响细胞增殖[14]。细胞的增殖以DNA复制、细胞分裂为基础，本实验结果显示电磁场作用后，DNA明显损伤，因而进一步抑制了细胞的增殖，这种影响和频率有关，找出其最佳频率将为电磁场在临床中的应用提供直接依据。
然而不同频率电磁场作用后DNA的损伤影响了哪些蛋白的表达，DNA中损伤了哪些基因片段、哪些是电磁场的“易感”基因、作用的最佳频率还等有待进一步研究。
参考文献
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