作者：郅敏，肖高铿，郅慧，董蕾，乔泰东，樊代明，吴开春
【关键词】 胃癌
【Abstract】 AIM: To identify and analyze a peptide binding specifically to blood vessels of human gastric cancer by phage displayed C7C peptide library in vivo and to model its three dimensional structure of the peptide by computer. METHODS: Animal models were established using subrenal capsular assay (SRCA) in immunosupressed mice implanted with human gastric cancer xenografts. The phage displayed C7C peptide library was injected intravenously into mice. After 4 rounds of selection， 14 clones were picked up randomly and sequenced inpidually. The homing ability to human umbilical vein endothelial cells (HUVEC ) of peptide CGNSNPKSC was determined by cellELISA， with SGC7901， Eca109， LoVo and HepG2 cells as control. Its three dimensional structure of peptide CGNSNPKSC was also established by computer modeling techniques. RESULTS: Fourteen clones were obtained and they displayed two kinds of peptides. The binding ability of a cyclic peptide of CGNSNPKSC toward HUVEC was higher than that of SGC7901， Eca109， HepG2 and LoVo cells. The three dimensional structure of the peptide of CGNSNPKSC was modeled successfully. CONCLUSION: The peptide of CGNSNPKSC has high binding ability to HUVEC and its stable structure and highly hydrophilic character help it form a flexible epitope of antigen. The peptide of CGNSNPKSC can be used in target therapy of tumor angiogenesis.
【Keywords】 gastric cancer; phage displayed peptide library; angiogenesis; peptides; structure modeling
【摘要】 目的: 利用噬菌体随机环七肽库在小鼠肾包膜下荷人胃癌模型体内筛选能够与人胃癌血管内皮细胞结合的特异性分子，对其多肽进行计算机空间结构模拟分析. 方法：制备免疫抑制小鼠肾包膜下人胃癌移植瘤模型，用随机环七肽库在其体内进行4轮筛选，对随机获得的14个克隆进行测序. 通过细胞ELISA检测所得到的特异性小肽在脐静脉内皮细胞（HUVEC），SGC7901，LoVo，Eca109及HepG2细胞系上的结合能力. 并通过计算机分子模拟多肽CGNSNPKSC的空间结构. 结果：成功获得14个噬菌体克隆，并呈现出2种氨基酸序列，其中多肽CGNSNPKSC，相比于对照细胞SGC7901， LoVo， Eca109， HepG2，其同HUVEC结合能力明显增强. 利用计算机技术成功地模拟并分析了该多肽的空间结构. 结论：多肽CGNSNPKSC同血管内皮细胞结合能力较强；空间结构稳定，是一个高亲水多肽，更容易形成折曲的抗原表位，很有可能是一个极具肿瘤血管靶向治疗前景的多肽.
【关键词】 胃癌;噬菌体随机肽库;血管生成;多肽;结构模拟
0引言
大量实验［1，2］证实，肿瘤生长、转移和预后均与肿瘤血管关系密切，采用肿瘤血管抑制治疗有以下几个明显优势：①血管内皮细胞基因稳定，不易产生耐药性；②毒副作用少，可长期用药；③一种药物可用于多种肿瘤；④无遗传毒性，不造成继发恶性变，利于长期使用. 因此寻找肿瘤血管特异表达分子进行特异性肿瘤血管治疗具有十分重要的意义. 采用噬菌体随机肽库技术，可在欲筛选的靶标分子结构不明确的情况下，筛选出一些能与靶分子结合的特异性多肽［3，4］. 我们应用噬菌体随机肽文库筛选技术，在荷胃癌瘤组织的免疫抑制小鼠模型体内筛选能够与胃癌移植瘤血管内皮相结合的多肽，旨在为胃癌血管抑制治疗提供有效的作用靶点.
1材料和方法
1.1材料
1.1.1肽库噬菌体随机环七肽库（Ph.D.-C7CTM Phage display peptide library）：购自美国New England Biolabs公司，其滴度为1.5×1013噬斑形成单位（pfu），多样性为2.7×109 transformants，在其插入随机七肽序列两端各添加一个半胱氨酸（Cysteine，C），这两个半胱氨酸形成二硫键，从而使随机七肽的空间结构相对稳定. 宿主菌为大肠杆菌E.coli 2738. 测序引物（96g sequencing primer）序列为: 5′HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG3′.
1.1.2细胞系、动物及标本人胃腺癌细胞系SGC7901、人结肠癌细胞系LoVo、人食管癌细胞系Eca109与人肝癌细胞系HepG2均为第四军医大学西京医院消化病研究所保存. 正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)按
参考文献
［5］自行分离培养. BALB/c小鼠，20只，雌雄不拘，体质量20～22 g，由第四军医大学动物中心提供. 标本均来自西安交通大学第二医院普外科胃大部切除或全胃切除，术前经活检，本院病理科确诊为胃低分化腺癌.1.1.3其他试剂RPMI 1640培养基（Gibco公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；HUVEC培养液（Cell Applications公司）；抑蛋白酶肽（aprotinin）、亮抑制肽（leupeptin）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、5′溴4‘氯3’吲哚βD半乳糖苷（Xgal）和异丙基βD硫代半乳苷（IPTG）(Sigma公司)；辣根过氧化物酶标记的抗噬菌体mAb(HRPantiM13)（Pharmacia Biotech公司）.
1.2方法
1.2.1噬菌体随机环七肽库的体内筛选和测序参照文献［6］制备环磷酰胺（CTX）免疫抑制小鼠肾包膜下移植瘤小鼠模型（SRCA），将手术过程中获得的胃癌组织切割成1 mm×1 mm×2 mm大小，植入小鼠肾包膜下. 术后第6日，戊巴比妥钠150 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠，750 mL/L乙醇浸泡5 min后，尾静脉内注入1×1011 pfu的噬菌体环七肽库，其余步骤同文献［6］. 10 h后长出蓝色噬斑后，随机挑取约250个分隔良好的蓝色噬斑，分别加入5 mL LB，37℃，250 r/min扩增12 h后进行噬菌体纯化. 纯化后的噬菌体经滴定计数后，以与前次相同的滴度注射入小鼠，用于再一轮筛选，如此重复4次. 将第4轮淘筛后的噬菌体液不经扩增，直接感染E.coli 2738铺到LB琼脂糖平皿上，10 h后随机挑取分隔良好的14个蓝色噬斑，加入2 mL LB培养液中，37℃振摇4 h，送上海生工公司进行测序.
1.2.2细胞培养及ELISA
1.2.2.1细胞培养SGC7901， LoVo， Eca109和HepG2细胞系均按常规进行细胞培养. 取健康顺产妇脐带按文献［5］分离HUVEC，培养于HUVEC培养液中，并经抗人CD31 mAb染色证实分离细胞纯度为90%以上. 实验所用的HUVEC均使用传一代细胞. 1.2.2.2细胞ELISA检测全部培养细胞接种于96孔板至终密度为1×104/孔，1 g/L戊二醛固定细胞，10 g/L BSA封闭过夜；加入1×1011 pfu的呈现CGNSNPKSC多肽的噬菌体，37℃孵育2 h；经PBST重复洗涤3次，加入50 μL HRP antiM13 mAb（1∶3000），37℃孵育2 h；PBST洗涤4次后加入TMB，室温30 min. 加入2 mol/L h3SO4终止反应，自动ELISA仪上测A450 nm值. 以PBS作为阴性对照. 以噬菌体随机12肽库（PHD12）（1×1011 pfu）作为阳性对照，每个样本选取3个复孔. 采用公式S/N=样品平均A450 nm值/PBS组平均A450 nm值，其中S/N≥2.1作为阳性结果，而S/N&<2.1作为阴性结果. S代表样本组，N代表PBS组.
1.2.3多肽的分子模建及预测表位分析采用GROMACS 3.2软件包，对9个多肽进行能量最优化与分子动力学模拟. 整个模拟过程按如下步骤进行：运用最陡下降法(steepest descent method)对多肽进行2000步优化计算，以避免做分子动力学时原子间的不合理碰撞；在多肽周围加上1 nm厚度的水层，保证其有足够构象变化空间；对溶液状态下的多肽设定pH=7；在298 K的恒定温度下进行20 ps的分子动力学模拟(molecular dynamical simulation，MDS)，模拟步长为1 fs，非键相互作用采用0.95 nm的截断值(cut off)，MDS得到的最后构象作为多肽在水溶液中的分析构象. 全部工作在RedHat Linux 9.0操作系统，CPU为AMD2500下完成.
2结果
2.1筛选和测序4轮筛选结束后，对随机挑选的14个噬菌体克隆进行测序，其中的12个克隆呈现出CGNSNPKSC序列，2个克隆呈现CPHNLTKLC序列.
2.2细胞ELISACGNSNPKSC多肽对HUVEC结合能力明显高于对SGC7901， LoVo， Eca109及HepG2细胞，接近于阳性对照噬菌体（Fig 1）.
2.3CGNSNPKSC多肽的分子结构模拟及预测表位分析分析DMS的最终构象，如Fig 2所示，5个分子内氢键稳定了结构（其中二硫键是黄色实线，黄色虚线是分子内氢键）. 2个半胱氨酸残基形成1对二硫键结构，限制了分子柔性，形成了一个α螺旋（Fig 3的白色飘带）与一个β转角（Fig 3的红色飘带）. 分析该肽的亲水与疏水性，与水接触的极性表面积为6.932 nm2(693.2平方埃)，而疏水表面积仅为3.889 nm2(388.9平方埃)，说明该9肽具有良好的亲水性.
3讨论
近20年的研究表明，肿瘤的发生和发展与肿瘤新生血管密切相关，寻找肿瘤血管特异性标志物是肿瘤血管靶向治疗的关键. 然而，由于肿瘤血管的特殊性导致不能有效得到特异性的肿瘤血管标志物，如这些特异性分子只存在于肿瘤血管，在正常血管内皮细胞中不表达或者痕量级表达［7］；分离和培养存在困难，至今尚未攻克；长期体外培养内皮细胞也会使其丧失特性；体内实验多是在裸鼠体内进行，瘤块的生长多是依靠肿瘤细胞自身的分裂，在一定程度内很少依赖新生血管，血管也多为小鼠源性而非人源性. 因此，在人体内进行直接筛选是最佳模式，但是这样首先会受到伦理学的挑战，可行性极差［8，9］. 为了能够模拟肿瘤在人体内生存和生长的环境，我们利用免疫抑制小鼠制备了荷人胃癌组织移植瘤模型，并用噬菌体随机环七肽库对其进行了体内筛选，获得两条多肽，其中一条CGNSNPKSC多肽在14个克隆中呈现12次，说明该肽具有高选择的特异性. 在不同肿瘤细胞和血管内皮细胞上的结合实验也证实了这一点.
我们把CGNSNPKSC多肽序列输入BLASTP中进行检索，虽然发现该序列与已知蛋白在一级结构上没有同源性，但不排除CGNSNPKSC多肽同某种血管内皮相关蛋白的功能表位在空间结构上相同或相似. 按照氨基酸的理化性质来分析这段多肽序列，我们发现，除了构成二硫键的2个C为疏水性氨基酸外，其余7个氨基酸均为高亲水性氨基酸，这种亲水多肽更容易形成折曲的抗原表位［10］. 为了能够更好了解该段多肽的空间结构，我们利用计算机技术对其三维结构进行了模拟，模拟结果也证实了这个多肽的空间结构相对稳定，仅仅9个氨基酸就构成了一个α螺旋以及一个β转角，并具有较高亲水性，说明该肽很有可能在空间结构和功能上高度模拟某种血管内皮相关蛋白，极具肿瘤血管靶向治疗前景.
参考文献
［1］ Xue Y， Bi F， Zhang X， et al. Inhibition of endothelial cell proliferation by targeting Rac1 GTPase with small interference RNA in tumor cells ［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2004;320(4):1309-1315.
［2］ Folkman J. Angiogenesis and apoptosis ［J］. Semin Cancer Biol， 2003; 13（2）:159-167.
［3］ 秦鑫，赵宁，张英起，等. 人转铁蛋白受体结合肽的噬菌体肽库筛选与鉴定［J］. 第四军医大学学报， 2004;25(12): 1117-1119.
Qin X， Zhao N， Zhang YQ， et al. Isolation and identification of a novel peptide binding to human transferrin receptor from phagedisplay library ［J］. J Fourth Mil Med Univ， 2004;25(12):1117-1119.
［4］ 万一，石继红，韩苇，等. 肿瘤坏死因子α在噬菌体表面的呈现及鉴定［J］. 第四军医大学学报， 2004;25(6): 499-502.
Wan Y， Shi JH， Han W， et al. Display of TNFα on the phage surface and identification of recombinant phageTNFα［J］. J Fourth Mil Med Univ， 2004; 25(6): 499-502.
［5］ Jersmann HP， Hii CS， Hodge GL，et al. Synthesis and surface expression of CD14 by human endothelial cells［J］. Infect Immun， 2001;69(1): 479-485.
［6］ 王瑜，吴开春，聂永战，等. 胃癌特异性血管结合多肽的体内筛选和初步鉴定［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2003; 19(5): 469-472.
Wang Y， Wu KC， Nie YZ， et al. Invivo screening and characterization of peptides specific for vasculature of gastric cancer ［J］. Chin J Cell Mol Immunol， 2003; 19(5): 469-472.
［7］ Bikfalvi A， Bicknell R. Recent advances in angiogenesis， antiangiogenesis and vascular targeting［J］. Trends Pharmacol Sci， 2002; 23(12): 576-582.
［8］ Arap W， Kolonin MG， Trepel M， et al. Steps toward mapping the human vasculature by phage display［J］. Nat Med， 2002; 8(2): 121-127.
［9］ Zurita AJ， Arap W， Pasqualini R. Mapping tumor vascular persity by screening phage display libraries ［J］. J Control Release， 2003; 91(12): 183-186.
［10］ 郭宗儒. 药物分子设计的模拟原理［J］. 药学学报， 1997; 32(12):950-955.
Guo ZR. Mimetic principle of molecular drug design ［J］. Acta Pharmaceutic Sin， 1997; 32(12):950-955.