作者：刘芳 刘均涛 张静 马传响 宋亮 陈幽婷
【摘要】 目的观察非竞争性NMDA受体拮抗剂地艹卓西平马来酸盐(MK-801)在低剂量时对小鼠焦虑、抑郁以及学习记忆能力的影响。方法将昆明小鼠随机分成对照组和MK-801组，采用高架十字迷宫、强迫游泳实验、悬尾实验、开场实验以及Morris水迷宫等方法，检测药物对小鼠行为的影响。结果与对照组相比，MK-801组抑郁模型中的不动时间减少(P&<0.01);焦虑模型中在入开臂次数及停留时间的百分比增加(P&<0.01)，入臂总次数与总时间也增加;开场实验中运动能力增加(P&<0.01);Morris水迷宫中小鼠学习记忆能力下降(P&<0.01)。结论低剂量MK-801并未对小鼠产生抗焦虑以及抗抑郁的效果，但可降低学习记忆能力。
【关键词】 MK-801;抗焦虑;抗抑郁;学习记忆
Abstract： ObjectiveTo investigate the effect of low dose of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonist MK-801 on the ethology of anxiety， depression， learning and memory in mice. MethodsMale Kunming mice were randomly pided into control group and MK-801 group， and the effect of the drug on the mouse behavior was evaluated by elevated plus maze test， forced swimming test， tail suspension test， open-field test and Morris water maze. ResultsCompared with the control group， the MK-801 group significantly reduced the immobility duration in the depression model group (P&<0.01)， increase the percentage of open arm entries and open arm duration (P&<0.01)， but also increased the total entries and durations， improved the locomotivity in the open-field test. (P&<0.01)， impaired the ability of learning and memory in the Morris water maze (P&<0.01). ConclusionLow dose of MK-801 cannot cause anti-anxiety and anti-depressant effects on mice， but can induce impairment of learning and memory.
Key words: MK-801; anti-anxiety; anti-depression; learning and memory
焦虑和抑郁是严重威胁人类健康的精神疾病，研究资料表明，随着年龄的增长其发病率也在逐渐增加。越来越多的证据表明，谷氨酸系统在情感调节的病理生理过程中起到非常重要的作用，而且大多数患者存在焦虑和抑郁共病的状况。而对于学习与记忆过程的研究中也发现谷氨酸受体通道在诱导突触可塑性以及记忆加工方面的作用亦非常重要。目前，在对啮齿类动物的研究中表明，阻断谷氨酸受体，特别是NMDA受体，可以产生抗抑郁[1]、抗焦虑以及破坏动物学习记忆能力的作用[2]。地艹卓西平马来酸盐(dizocilpine，MK-801)是一种选择性极强的非竞争性NMDA受体拮抗剂[3]，对一些神经系统疾病有治疗作用。然而进一步研究却发现其有较严重的副作用。因此，目前常用来作为动物实验的工具药。对于我国常用的昆明小鼠这一品系，低剂量MK-801是否也可以产生较好的抗焦虑、抗抑郁的效果?对小鼠学习记忆方面是否也产生影响?我们进行了观察。
1材料和方法
1.1实验动物昆明小鼠，雄性，体重25~30 g，由徐州医学院实验动物中心提供。于12 h昼夜节律下(8:00—20:00)笼养，保证动物饮水与进食自由，小鼠适应实验环境1周后将其随机分成对照组和MK-801组。
1.2药物与给药MK-801(Sigma公司)溶于生理盐水中，腹腔注射剂量为0.3 mg/kg，对照组腹腔注射等体积生理盐水。注射体积为10 ml/kg，于试验前30 min注射(每天9:00—12:00之间进行行为学实验)。
1.3行为学实验
1.3.1高架十字迷宫实验(elevated plus maze test)
参考文献
[4]。高架十字迷宫实验装置参照香港友诚生物科技有限公司产品进行精确复制。实验记录人员在距离测试箱1 m处观察记录下述指标：①进入开臂次数(open arm entry，OE);②进入开臂时间(open arm time，OT)，单位：s;③进入闭臂次数(close arm entry，CE);④进入闭臂时间(close arm time，CT)，单位：s。每只小鼠测试5 min。由以上①～④分别计算出：①进入开臂和闭臂的总次数(OE+CE);②在开臂和闭臂停留的总时间(OT+CT);③进入开臂次数比例(OE%)：OE/(OE+CE)×100%;④开臂停留时间比例(OT%)：OT/(OT+CT)×100%。1.3.2强迫游泳实验(forced swimming test)
参考文献
[5]。将小鼠置于水深10 cm(高30 cm，直径18 cm)的透明塑料桶里，水温25℃，观察小鼠6 min，适应2 min，记录后4 min内的累计不动时间(s)[6](不动的行为评判标准为停止挣扎或呈漂浮状态，身体保持垂直姿势，仅有细小的肢体运动以保持头部漂浮在水面上)。1.3.3悬尾实验(tail suspension test)用胶布将鼠尾距其尖部2 cm处贴在一水平棍上，使小鼠成倒挂状态，其头部距离台面15 cm，观察记录小鼠在6 min内的不动时间(s)[7]。
1.3.4开场实验(open-field test)
参考文献
[8]。开场实验箱(30 cm×30 cm×16 cm)四周以及箱底为黑色，底面由白线划成25块相等的方格(5 cm×5 cm)，上方敞开。观察时轻提鼠尾将动物放在敞箱中央，每次测试3 min，记录小鼠运动能力(即爬格数：观察期内小鼠四肢所爬过的格子数)。1.3.5Morris水迷宫(Morris water maze)参考文献[9]。本实验所用Morris水迷宫实验装置参照安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司的水迷宫尺寸进行精确复制。 池壁上以4个等距离点，即东(E)、南(S) 、西(W)、北(N)，将水池分为4个象限，分别称SW、NW、SE 及NE 象限，在NE 象限正中有一圆形站台。小鼠每天训练4次，将小鼠头朝池壁按东、南、西、北4 个入水点轻轻放入水池中。记录小鼠自入水到四肢爬上平台所需的时间， 作为逃避潜伏期。小鼠爬上平台后，让其停留10 s;若入水后60 s 内未能找到平台， 或未能爬上平台， 将小鼠放置于平台上站立10 s， 然后从平台上取下休息30～60 s， 再进行下一次训练。 训练时间5天，每天于第1次训练前30 min腹腔注射MK-801或生理盐水，连续注射5天。训练结束后第1天检测其空间短期记忆，检测内容为定位航行实验。定位航行实验中，选择SW象限的中心作为入水点，将小鼠面向池壁放入水中，检测其逃避潜伏期。
1.4统计学处理采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，实验数据以(±s)表示，采用独立样本t检验(independent amples test)进行分析，P&<0.05认为差异有统计学意义。
2结果
2.1低剂量MK-801对小鼠焦虑样行为的影响与对照组比较，MK-801组OE%、OT%均显著升高(P&<0.01);OE+CE、OT+CT与对照组相比差异亦有统计学意义(P&<0.01，P&<0.01)。见表 1。表1小鼠高架十字迷宫行为学测试结果
2.2低剂量MK-801对小鼠不同时间的影响与对照组相比，MK-801组在强迫游泳实验中明显缩短不动时间(P&<0.01);在悬尾实验中，小鼠不动时间亦明显缩短(P&<0.01)。见表 2。
2.3低剂量MK-801对小鼠爬格数的影响与对照组相比，MK-801组的小鼠爬格数明显增加(P&<0.01)。见表 3。表2小鼠强迫游泳实验、悬尾实验不同时间测试结果表3小鼠开场实验行为学测试结果
2.4低剂量MK-801对小鼠空间学习记忆能力的影响与对照组相比，MK-801组的小鼠学习成绩和撤药第1天潜伏期明显延长(P&<0.01)。见表 4。表4小鼠Morris水迷宫实验行为学测试结果
3讨论
高架十字迷宫是广泛使用的焦虑模型，而抑郁模型方面，强迫游泳试验和悬尾试验亦被普遍应用。高架十字迷宫作为国际上公认的测试动物焦虑行为的首要装置[10]，主要检测动物的非条件性反射，它以动物自发性行为为基础，不需要特殊训练，利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧心理，形成动物的矛盾冲突来考察动物的焦虑状态。强迫游泳实验(又称Porsolt实验或者行为绝望实验)以及悬尾试验是目前评估抗抑郁药物效果使用最为普遍的动物模型[11]。本实验采用腹腔注射0.3 mg/kg这样一个较低剂量进行实验[12]，结果发现在高架十字迷宫试验中，MK-801不仅增加小鼠进入开臂的百分数(OE%)以及在开臂停留时间的百分数(OT%)，亦增加了小鼠入臂总次数和总时间。但是，抗焦虑效果是以不改变动物入臂总次数和总时间为前提。因此，0.3 mg/kg剂量并不能使小鼠产生抗焦虑样行为学改变。但亦有研究表明，MK-801在0.1 mg/kg的时增加老鼠入开臂的时间但不影响其入臂的次数[13]。这或许与药物浓度的增加有关，这种行为上的差异可能存在一种药物剂量相关性;又或者与老鼠的品系和测定仪器的不同有一定关系，需要进一步的实验来验证。
在本实验的强迫游泳及悬尾实验中，0.3 mg/kg剂量的MK-801明显缩短了小鼠的不动时间，似乎表明此低剂量的MK-801具有抗抑郁效果。但需要注意的是，这也不排除药物由于增加小鼠自主活动能力所产生的假阳性结果。特别是作用于谷氨酸能神经的药物，因为谷氨酸同样也与运动相关[14]。因此我们进行了自主活动能力评判的开场实验，验证这种假阳性结果是否存在。结果表明0.3 mg/kg剂量的MK-801在减少小鼠不动时间的同时也明显增加了自主活动能力。因此，在上述实验中得出抗抑郁的结果可能属于假阳性。尽管如此，由于我们并没有制作一个与行为学相关的剂量反应曲线，所以不能排除更低剂量的MK-801的抗抑郁效果。
Morris水迷宫模型[15]与其他的此类检测工具相比，是将实验动物的学习记忆障碍和感觉、运动缺陷等分离开来，减少了它们对学习记忆过程检测的干扰。同时操作简便，数据误差较小。因此Morris水迷宫在精神病学研究领域得到了广泛应用，其中之一就是探讨药物对动物空间学习记忆能力的影响。 目前有大量资料表明NMDA受体中的谷氨酸受体通道在诱导突触可塑性以及记忆加工方面起到非常重要的作用，参与学习与记忆过程。0.3 mg/kg剂量的MK-801明显降低小鼠空间学习与记忆能力，其训练5天的平均成绩明显低于对照组(P&<0.01)，在撤药后第1天的定位航行测试中，其记忆成绩也远不如对照组小鼠。表明低剂量MK-801可以破坏小鼠的空间学习记忆能力。那么这种破坏是不是具有剂量依赖性?本课题组用0.1 mg/kg剂量的MK-801对小鼠进行相同的水迷宫测试，发现其学习能力及记忆水平与对照组之间的差异无统计学意义，而0.2 mg/kg剂量的时候，实验结果已经与对照组之间有统计学差异(P&<0.05)，提示至少在0.1~0.3mg/kg这个浓度范围内，MK-801对昆明小鼠的空间学习记忆能力具有剂量依赖性。那么在这个剂量范围之外，或者改变老鼠的品系以及训练方式，MK-801是否继续表现出破坏学习记忆的特性，还有待进一步研究。因为已有研究表明，在某些特殊的实验环境下MK-801表现出提高记忆水平的作用[16]。
总之，在本研究中，0.3 mg/kg低剂量的MK-801并未对昆明小鼠产生抗焦虑以及抗抑郁的效果，在学习记忆模型中，此药物剂量可以明显降低其空间学习以及记忆能力。
【参考文献】
[1]Dhir A， Kullkarni SK. Possible involvement of nitric oxide (NO) signaling pathway in the antidepressant-like effect of MK-801(dizocilpine)， a NMDA receptor antagonist in mouse forced swim test [J]. Indian J Exp Biol， 2008，46(3):164-170.
[2]Enomoto T， Ishibashi T， Tokuda K， et al. Lurasidone reverses MK-801-induced impairment of learning and memory in the Morris water maze and radial-arm maze tests in rats [J]. Behav Brain Res，2008，86(2):197-207.
[3]Bubenikováa V， Votava M， Horácek J， et al. The effect of zotepine， risperidone， clozapine and olanzapine on MK-801-disrupted sensorimotor gating [J]. Pharmacol Biochem Behav， 2005，80(4):591-596.
[4]Rezvanfard M， Zarrindast MR， Bina P. Role of ventral hippocampal GABA(A) and NMDA receptors in the anxiolytic effect of carbamazepine in rats using the elevated plus maze test [J]. Pharmacology，2009，84(6):356-366.
[5]Ghasemi M， Raza M， Dehpour AR. NMDA receptor antagonists augment antidepressant-like effects of lithium in the mouse forced swimming test [J]. J Psychopharmacol， 2010，24(4):585-594.
[6]Galeotti N， Bartolini A， Ghelardini C. Blockade of intracellular calcium release induces an antidepressant-like effect in the mouse forced swimming test [J]. Neuropharmacology， 2006，50(3):309-316.
[7]Belozertseva IV， Kos T， Popik P， et al. Antidepressant-like effects of mGluR1 and mGluR5 antagonists in the rat forced swim and the mouse tail suspension tests [J]. Eur Neuropsychopharmacol， 2007，17(3):172-179.
[8]Kuzmin A， Madjid N， Terenius L， et al. Big dynorphin， a prodynorphin-derived peptide produces NMDA receptor-mediated effects on memory， anxiolytic-like and locomotor behavior in mice [J]. Neuropsychopharmacology，2006，31(9):1928-1937.
[9]Enomoto T， Ishibashi T， Tokuda K， et al. Lurasidone reverses MK-801-induced impairment of learning and memory in the Morris water maze and radial-arm maze tests in rats [J]. Behav Brain Res， 2008，186(2):197-207.
[10]Foreman MM， Hanania T， Eller M. Anxiolytic effects of lamotrigine and JZP-4 in the elevated plus maze and in the four plate conflict test [J]. Eur J Pharmacol， 2009，602(2-3):316-320.
[11]Petit-Demouliere B， Chenu F， Bourin M. Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity [J]. Psychopharmacology (Berl)， 2005，177(3):245-255.
[12]Ahn YM， Suk MSSeo， Kim SH， et al. The effects of MK-801 on the phosphorylation of Ser338-c-Raf-MEK-ERK pathway in the rat frontal cortex [J]. Int J Neuropsychopharmacol， 2006，9(4):451-456.
[13]Wiero′ska JM， Szewczyk B， Paucha A， et al. Involvement of CRF but not NPY in the anxiety regulation via NMDA receptors [J]. Pol J Pharmacol， 2003，55(6):1119-1124.
[14]Riedel G， Platt B， Micheau J. Glutamate receptor function in learning and memory [J]. Behav Brain Res， 2003，140(1-2):1-47.
[15]Ferretti V， Sargolini F， Oliverio A， et al. Effects of intra-accumbens NMDA and AMPA receptor antagonists on short-term spatial learning in the Morris water maze task [J]. Behav Brain Res， 2007，179(1):43-49.
[16]Caramanos Z， Shapiro ML. Spatial memory and N-methyl-daspartate receptor antagonists APV and MK-801: memory impairments depend on familiarity with the environment， drug dose， and training duration [J]. Behav Neurosci， 1994，108(1):30-43.