作者：张明阳 刘亚君 周美艳 陈晏 蔡慧明 宋苏沛 戴体俊
【摘要】 目的比较鞘内注射和侧脑室注射异氟烷对小鼠的镇痛作用，从整体水平探讨异氟烷的镇痛作用部位。方法用热板法、甲醛法观察、比较鞘内注射(it)和侧脑室注射(icv)异氟烷对小鼠热板法痛阈(HPPT)及抖足时间和抬足次数的影响。用免疫组化方法观察鞘内注射异氟烷对甲醛小鼠脊髓 Fos蛋白表达的影响。结果热板实验中，与人工脑脊液组相比，it异氟烷0.02、 0.04、 0.08 μl/g 能够剂量依赖性地引起HPPT的增高(P&<0.01或P&<0.05);icv以上剂量的异氟烷对HPPT均无明显影响(P&>0.05)。甲醛法实验中，it异氟烷0.01、0.02、0.04 μl/g能剂量依赖性地减少抖足时间和抬足次数(P&<0.01或P&<0.05);相同剂量的异氟烷icv对抖足时间和抬足次数均无明显影响(P&>0.05)。鞘内注射异氟烷可抑制甲醛小鼠脊髓Fos表达(P&<0.01)。结论在正常小鼠整体水平异氟烷镇痛部位主要在脊髓，脑可能不是主要镇痛部位。
【关键词】 异氟烷;镇痛;作用部位;鞘内注射;侧脑室注射
Abstract： ObjectiveTo compare the anesthetic effects of intrathecal and intracerebroventricular injections of isoflurane in mice and investigate the sites where isoflurane exerts its effects of anesthesia. MethodsHot-plate test and formaldehyde test were used to compare the effects of intrathecal (i.t.) and intracerebroventricular (i.c.v) injections of isoflurane on the pain threshold in hot-plate test (HPPT)， paw shaking duration and times of paw lifting. Immunohistochemical method was used to observe the effect of intrathecal of isoflurane on the Fos expression in the spinal cord in mice under formaldehyde stimulation. Results In the hot-plate test， isoflurane at 0.02， 0.04 and 0.08 μl/g (i.t.) significantly and dose-dependently increased the HPPI (the pain index in hot-plate test) in mice (P&<0.05 or P&<0.01)， while isoflurane at the same dosages had no marked effect (P&>0.05). In the formaldehyde test， isoflurane at 0.01， 0.02 and 0.04 μl/g (i.t.) significantly and dose-dependently decreased the paw-shaking duration and the times of paw-lifting in phase Ⅰ and phase Ⅱ (P&<0.01， P&<0.05)， while isoflurane of the same dosages had no evident effect under formaldehyde stimulation (P&>0.05). Intrathecal injection of isoflurane could inhibit the Fos expression in the spinal cord in mice under formaldehyde stimulation. (P&<0.01). ConclusionThe primary mediator of analgesic effect produced by isoflurane might be situated in the spinal cord rather than the brain.
Key words: isoflurane; analgesia; site of action; intrathecal injection; intracerebroventricular injection
吸入麻醉药在临床麻醉中应用广泛，镇痛也是临床麻醉的首要任务，但吸入麻醉药的镇痛作用部位及其机制至今仍未明确。以往的离体研究表明，吸入麻醉药镇痛的作用部位主要在脊髓，脊髓上中枢也有重要的调节作用[1-2]。但是证明脊髓是吸入麻醉药镇痛作用主要部位的研究证据都是在破坏了动物原来的中枢神经系统和血液循环系统或在离体时得到的[3-5]，而离体和在体的实验结果可能会有很大不同。本研究旨在探索吸入麻醉药在正常动物整体水平的镇痛作用部位。本研究比较常用吸入麻醉药异氟烷(isoflurane，iso)在脑和脊髓的镇痛作用。采用鞘内注射(intrathecal injection， it)和侧脑室注射(intracerebroventricular injection， icv)，此方法可使药物选择性作用于脑和脊髓，最大限度地降低药物作用部位的弥散性，同时也保持了动物中枢神经系统和血液循环系统的完整性。
1材料和方法
1.1试剂和仪器异氟烷(批号:25626Z8)，英国雅培制药有限公司;人工脑脊液(aCSF);免疫组化试剂盒(Santa Cruze，北京中杉公司分装);YLS智能热板仪，淮北正华生物仪器设备有限公司;微量进样器，上海医用激光仪器厂。
1.2实验动物及分组昆明种小鼠192只，体重18～22 g，由徐州医学院实验动物中心提供〔SCXK (苏)200222 0022〕。实验前，所有小鼠在 23℃～25℃ 的室温下饲养 24 h。在热板法实验中，雌性昆明种小鼠80只，随机分为侧脑室注药组和鞘内注药组，侧脑室注药组分4个亚组，分别注射aCSF 0.04 μl/g(a1组)，异氟烷 0.02 μl/g(a2组)，0.04 μl/g(a3组)， 0.08 μl/g(a4组)。鞘内注药组分为4个亚组，分别注射aCSF 0.04 μl/g(b1组)，异氟烷0.02 μl/g(b2组)，0.04 μl/g(b3组)，0.08 μl/g(b4组)。在甲醛法实验中，昆明小鼠80只，雌雄不拘，随机分为侧脑室注药组和鞘内注药组，侧脑室注药组分4个亚组，分别注射aCSF 0.02 μl/g(c1组)，异氟烷 0.01 μl/g(c2组)，0.02 μl/g(c3组)，0.04 μl/g(c4组)。鞘内注药组分为4个亚组，分别注射aCSF 0.02 μl/g(d1组)，异氟烷0.01 μl/g(d2组)，0.02 μl/g(d3组)，0.04 μl/g(d4组);在免疫组化实验中，小鼠32只，雌雄不拘，分为4组：aCSF组(it aCSF 0.02 μl/g)，aCSF+f组(it aCSF 0.02 μl/g+足底注射2%甲醛20 μl)，iso组(it iso 0.02 μl/g)，iso+f组(it iso 0.02 μl/g+足底注射2%甲醛20 μl)。
1.3实验方法
1.3.1热板法参考文献[6]。雌性昆明种小鼠置于热板上〔(55±0.5) ℃〕，记录从其足部接触热板到开始添后足的时间(s)作为小鼠拯救法痛阈(HPPT)，剔除HPPT大于30 s或小于5 s的动物，为防止足部烫伤，观察的截止时间为60 s，超过60 s者， HPPT计为60 s。用药前测小鼠的基础痛阈2次，间隔5 min， 取其均值。用药后5，10，15，20，25 min分别测出各组小鼠的HPPT。
1.3.2甲醛法参考文献[7]。各组小鼠注射aCSF或异氟烷后5 min后足底注射2%甲醛20 μl，记录60 min内小鼠舔足时间和抬足次数，前5 min的反应为Ⅰ相反应，之后为Ⅱ相反应。
1.3.3免疫组化实验小鼠经实验处理(同小鼠甲醛法实验，因以上的实验结果证实在整体水平脊髓是异氟烷镇痛的主要部位，因此在这部分实验中仅保留鞘内注射组)2 h后，腹腔注射水合氯醛麻醉，开胸暴露心脏，经左心室灌注固定:先用生理盐水25 ml快速灌注冲洗血液，继以4%多聚甲醛 40 ml( PBS 0.1 mol·L-1，pH 7.4)持续灌注15 min左右。取腰膨大上下 0.5 cm宽度的脊髓， 4%多聚甲醛中固定12 h，而后放入 30%蔗糖 (PB 0.1 mol·L-1，pH 7.4)中 ，置于4℃冰箱过夜，冰冻冠状连续切片，片厚30 μm，收集于0.1 mol·L-1的PBS中，以SP法作c-fos免疫组织化学反应。每只小鼠脊髓切片随机抽取10张 ，计数注射侧小鼠脊髓背角灰质Fos阳性神经元数量，取平均数作为该小鼠Fos阳性神经元数量。
1.4统计学处理实验数据用±s表示。用SPSS 16.0软件进行处理，组内比较采用配对t检验，组间比较采用单因素方差分析和q检验。检验水准：α=0.05。
2结果
2.1鞘内或侧脑室注射异氟烷对小鼠热板法痛阈的影响与人工脑脊液组相比， it异氟烷各组均能剂量依赖性地引起HPPT的增高(P&<0.01或P&<0.05)，HPPT与异氟烷的剂量之间呈正相关。给药后5 min，10 min，15 min，20 min，25 min时异氟烷的剂量和HPPT的相关系数分别为0.8，0.83，0.83，0.71，0.68(P值均&<0.01)。与人工脑脊液组相比， icv异氟烷各组对HPPT均无明显影响(P&>0.05)。见表1。
2.2鞘内或侧脑室注射异氟烷对小鼠甲醛法抖足时间和抬足次数的影响与人工脑脊液组相比， it异氟烷0.01、0.02、0.04 μl/g对Ⅰ相和Ⅱ相的抖足时间和抬足次数均有抑制作用(P&<0.01或P&<0.05)， 抑制强度与剂量呈负相关，见表2。相关系数分别为r=-0.91， -0.56，-0.91，-0.71(P值均&<0.01)。而在icv组，与人工脑脊液组相比， icv异氟烷0.01、0.02、0.04 μl/g对小鼠Ⅰ相和Ⅱ相抖足时间和抬足次数均没有明显影响(P&>0.05)。见表2表1鞘内或侧脑室注射异氟烷对小鼠热板法痛阈的影响 表2鞘内或侧脑室注射异氟烷对小鼠甲醛法抖足时间和抬足次数的影响
2.3鞘内注射异氟烷对甲醛小鼠脊髓Fos蛋白表达的影响Fos阳性神经元表现为细胞核呈棕褐色，胞质不着色。aCSF组小鼠两侧脊髓背角散在分布少量的 Fos阳性神经元，aCSF+f组小鼠注射侧脊髓背角有大量 Fos阳性神经元表达，，未注射侧脊髓背角只有少量 Fos阳性神经元散在分布。iso组小鼠脊髓Fos阳性神经元的数量与aCSF组相似 (P&>0.05)。iso+f组脊髓Fos阳性神经元的数量则少于aCSF+f组(P&<0.01)，见图1、表3。结果提示甲醛足底注射可刺激小鼠脊髓背角 Fos蛋白表达，it iso 0.02 μl/g对甲醛小鼠脊髓Fos蛋白表达有抑制作用。图1鞘内注射异氟烷对甲醛处理小鼠脊髓背角Fos表达的影响(免疫组化染色，×200)A.aCSF 组;B.aCSF+f 组;C.iso 组;D.iso+f 组表3鞘内注射异氟烷对甲醛处理小鼠脊髓背角神经细胞Fos表达的影响
以往研究吸入麻醉药作用部位的文献都是在离体时得到的，离体和在体的条件有很大不同，可能会影响实验结果的准确性。最近Yang等 [8]利用山羊模型在山羊降主动脉起始部给予乳化异氟烷，使其选择性作用于脊髓，证明了其作用部位主要在脊髓，但脊髓和脑仍不可避免的有血液相交通。本研究使用的方法最大程度地避免了动物的损伤，在整体水平探索了异氟烷的镇痛作用部位主要是在脊髓还是在脑，避免了离体时对动物正常状态的损伤，更具有说服力。it和icv能使异氟烷选择性的与脑和脊髓结合，避免了作用的弥散性。
通常吸入麻醉药通过吸入途径经肺进入血液循环通过血脑屏障，其最终作用部位在中枢神经系统，但这种给药途径作用于全身，而且管道较多，给实验和临床抢救带来不便。我们在国内最先报道了动物注射挥发性麻醉药通过血液循环作用于脑可以产生麻醉作用[9]，并以此类模型在国内外分别发表数十篇论文。异氟烷本来是通过吸入途径经血液循环作用于全身的，在血液循环中是否经过某些转化作用于神经系统产生镇痛作用，还是可以直接作用于神经系统产生镇痛作用尚不明确。
it和icv使异氟烷直接作用于脊髓和脑，能够反映异氟烷在脑和脊髓水平的镇痛效果。热板法和甲醛法分别反映了异氟烷对热刺激痛、化学炎性痛的镇痛效果。实验中it异氟烷最大剂量0.08 μl/g能够使HPPT接近最大值(60 s)，而icv 0.08 μl/g还没有镇痛作用。Fos表达可在一定程度上反映疼痛的程度，免疫组化实验中it异氟烷能抑制甲醛炎性痛小鼠脊髓的Fos表达。这些实验结果提示，异氟烷可以直接作用于脊髓(未通过血液循环)产生镇痛作用，在动物基本正常状态时脊髓对异氟烷的镇痛作用比脑更敏感，异氟烷的镇痛作用部位主要在脊髓。
异氟烷在脊髓的镇痛作用的确切机制还有待研究。最近的研究表明，异氟烷的镇痛作用和脊髓内的NMDA受体[10-11]、烟碱受体[12]等有关，而与GABAA受体[13]无关。我们将在脊髓镇痛模型上，进一步研究吸入麻醉药镇痛的确切部位及分子机制。
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