【摘要】 目的研究N-乙酰-L-半胱氨酸(N- acetylcysteine，NAC)对大鼠脑缺血再灌注引起应激性胃损伤的影响。方法采用四动脉结扎法建立大鼠全脑缺血模型，缺血后静脉注射NAC(150 mg/kg)，取胃后计数胃黏膜损伤指数(gastric mucosal damage index， GMDI)，测定胃黏膜组织中丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，采用原位检测 (TUNEL)法检测胃黏膜细胞凋亡情况 。结果NAC可以降低大鼠脑缺血再灌注引起应激性胃损伤时的胃黏膜损伤指数，使胃黏膜组织中MDA含量减少、SOD活性增强，抑制胃黏膜细胞凋亡。结论NAC对大鼠脑缺血再灌注引起的应激性胃损伤具有保护作用，这种保护作用是通过抑制氧化应激、减少胃黏膜细胞凋亡而实现的。
【关键词】 N-乙酰-L-半胱氨酸;脑缺血再灌注;胃黏膜损伤指数;超氧化物歧化酶;丙二醛
Abstract ： ObjectiveTo investigate the effect of antioxidant N-acetylcysteine (NAC) on brain ischemia /reperfusion-induced stress gastric mucosa injury in rats. MethodsRat models of brain ischemia/reperfusion were established by the four vessel occlusion method. Following brain ischemia， NAC (150 mg/kg) was injected into the femoral vein. The rats were finally sacrificed to investigate gastric mucosal damage index (GMDI) and determine the content of malondialdehyde (MDA) and the activity of superoxide dismutase (SOD) in gastric mucosa. The apoptosis of gastric mucosal cells was detected by TUNEL. ResultsInjection of NAC into the femoral vein could decrease gastric mucosal damage index in stress gastric injury， reduce the content of MDA and increase the activity of SOD in the gastric mucosa， and inhibit gastric mucosal cellular apoptosis following brain ischemia/reperfusion. ConclusionNAC could protect against brain ischemia/reperfusion-induced stress gastric injury by the inhibition of oxidative stress and redction of cell apoptosis in gastric mucosa.
Key words: N-acetylcysteine; brain ischemia/reperfusion; gastric mucosal damage index; superoxide dismutase; malondialdehyde
机体遭遇各种应激性反应如休克、脑损伤、严重外伤等情况时，胃通常是受累最早的器官。已有研究证实，急性脑血管病和颅脑外伤可以通过改变胃黏膜血流和胃黏膜形态，从而改变胃黏膜屏障，引起应激性胃黏膜损伤[1]。器官缺血再灌注(ischemia reperfusion)损伤实际上是氧化应激，由于机体氧化系统和抗氧化系统失衡，氧自由基(reactive oxygen species， ROS)产生增多，在体内蓄积过多，使器官组织的细胞膜脂质过氧化，从而造成损伤[2]。采用抗氧化剂防治器官缺血再灌注损伤已经受到了人们的重视。N-乙酰-L-半胱氨酸(N- acetylcysteine， NAC)是一种抗氧化剂，作为谷胱甘肽(glutathione， GSH)的前体物质，可以减轻氧化应激造成的机体损伤[3]。研究表明，NAC对大鼠脑和胃的缺血再灌注损伤具有保护作用[4-5]，但是NAC对大鼠脑缺血再灌注引起应激性胃损伤的影响及其可能的机制，目前少见报道。因此，本实验主要采用股静脉给予NAC，观察其对大鼠脑缺血再灌注引起的应激性胃损伤的影响，通过测定胃黏膜损伤指数(gastric mucosal damage index，GMDI)，胃黏膜组织中丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)活性变化及胃黏膜细胞凋亡率的变化，对其机制进行初步探讨。
1材料和方法
1.1实验药物和试剂NAC购自Sigma公司，SOD和MDA试剂盒购自南京建成生物研究所，TUNEL试剂盒购自Chemicon公司。
1.2实验动物和分组成年雄性健康SD大鼠，体重250～300 g，由徐州医学院实验动物中心提供。实验前禁食24 h，自由饮水。实验动物随机分为假手术组(Sham组，大鼠麻醉后直接取胃)、脑缺血再灌注组(BI/R组，大鼠脑缺血再灌注后取胃)、NAC +BI/R组(NAC组，大鼠脑缺血再灌注后、取胃前20 min股静脉给予NAC 150 mg/kg)，每组8只。
1.3模型和样本制备参照余红民等[6]的方法，采用大鼠四动脉结扎建立脑缺血再灌注模型。动物以20%水合氯醛(300~350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，分离双侧颈总动脉，电凝椎动脉。术后第2天动物于清醒状态下结扎双侧颈总动脉，全脑缺血15 min，再灌注24 h取胃(胃黏膜对于急性的损伤早期有很强的修复能力，又因这种修复能力有个体差异，为了避免上述因素对实验结果的影响，我们于再灌注24 h后取材检测)。取胃后沿胃大弯剪开，1%冷PBS冲洗干净，置于冰上展开，计数胃黏膜损伤指数后，留取胃黏膜标本：剪取一侧胃黏膜层置于5 ml EP管中，低温匀浆分别制成10%和1%的组织匀浆液，待测胃黏膜组织的MDA含量和SOD活性;取另一侧胃黏膜甲醛固定，常规脱水后石蜡包埋，切片，待用TUNEL法检测胃黏膜细胞凋亡率。
1.4胃黏膜损伤指数的测定以胃腺区局限于胃上皮的点状糜烂、溃疡、出血灶的长度累积计分：正常为0分，损伤≤1 mm计1分，&>1 mm并且≤2 mm计2分，&>2 mm并且≤3 mm计3分，余类推。损伤宽度超过1 mm时分数加倍。每组大鼠胃黏膜损伤分数的平均值为损伤指数[7]。
1.5MDA含量和SOD活性的测定分别采用硫代巴比妥(TAB)法和黄嘌呤氧化酶法，按照试剂盒中说明书步骤操作。
1.6胃黏膜细胞凋亡率的测定严格按试剂盒说明书操作，苏木素复染2 min，充分自来水冲洗， 中性树脂封片。光镜下观察到细胞壁完整，体积缩小，固缩成团或形成凋亡小体，胞核呈棕黄色的细胞即阳性细胞。用图像分析仪对阳性细胞数或表达强度进行半定量分析，TUNEL法中以高倍视野下阳性细胞数占细胞总数的百分比作为分析指标。
1.7统计学处理采用SPSS 13.0统计软件，实验数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P&<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1NAC对大鼠脑缺血再灌注后GMDI、MDA含量、SOD活性的影响BI/R组的GMDI、MDA含量明显高于Sham组(P&<0.01);NAC组的GMDI、MDA含量高于Sham组(P&<0.05 )，但低于BI/R组(P&<0.05 )。BI/R组的SOD活性明显低于Sham组(P&<0.01);NAC组的SOD活性低于Sham组(P&<0.05 )，但高于BI/R组(P&<0.05 )。见表1。表1NAC对大鼠脑缺血再灌注后GMDI、MDA含量、SOD活性的影响
3讨论
脑缺血再灌注损伤可以并发多个器官功能损伤甚至衰竭，其中胃功能损伤发生率较高，表现为胃黏膜的出血和坏死。主要原因是使胃黏膜的防御平衡失调，促进血小板聚集，血管痉挛或收缩致侧支循环血流量降低，使胃黏膜缺氧，最终又加重了血小板的活化和血管收缩，如此形成恶性循环使胃黏膜损伤加重。同时，脑缺血再灌注损伤还可以破坏机体的免疫功能，使ROS生成增多，清除减少，促进凋亡因子的活化。这些因素均可以加重胃黏膜应激性损伤。
NAC是一种抗氧化剂，可以提高器官缺血再灌注损伤时组织细胞中SOD的活性，减少MDA的含量，从而抑制再灌注早期ROS的生成，并促进ROS的清除。保护细胞膜和减轻线粒体损伤，抑制细胞内凋亡相关因子的激活，促进细胞增殖，减少细胞凋亡，发挥对缺血再灌注损伤的保护作用。此外，研究发现，NAC还可以抑制炎症反应和多种凋亡信号通路的激活，减少器官I/R时组织细胞的凋亡坏死，发挥对多种器官I/R损伤的保护作用[8]。
NAC可以增加器官缺血再灌注损伤时组织细胞的抗氧化性，抑制氧化应激时凋亡相关信号通路的激活，抑制细胞凋亡，减轻缺血再灌注损伤时组织细胞的损伤。然而NAC是否可以减轻由于大鼠脑缺血再灌注损伤所引起的胃黏膜损伤及其相关机制如何是我们感兴趣的问题。
本实验发现： 股静脉给予NAC可以使脑缺血再灌注大鼠胃黏膜组织中的MDA含量减少，SOD活性增加，提高胃黏膜组织的抗氧化性，减轻胃黏膜损伤。同时，NAC还可以抑制胃黏膜的细胞凋亡，使胃黏膜细胞增殖增多，减轻胃黏膜损伤。因此我们认为，NAC对大鼠脑缺血再灌注引起的胃黏膜损伤具有保护作用，其保护作用与抗氧化和抑制细胞凋亡有关。
本实验结果为临床上防治脑外伤引起的应激性胃黏膜损伤奠定了一定的理论基础，但其涉及到的具体信号通路有待于深入探讨。
【参考文献】
[1]刘菁，王燕斌.急性脑缺血模型大鼠胃肠血流变化及组织学形态[J]. 中华老年医学杂志，2006， 7(25): 539-542.
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[3]Bandyopadhyay D， Chattopadhyay A， Ghosh G，et al. Oxidative stress-induced ischemic heart disease: protection by antioxidants [J]. Curr Med Chem，2004，11(3):369-387.
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[5]周晓燕， 马小波， 张建福， 等. N-乙酰-L-半胱氨酸对大鼠胃缺血/再灌注损伤的影响 [J]. 徐州医学院学报， 2008， 28 (7) : 428-430.
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[7]Zhang YM， Wei EQ， Hu X，et al. Administration of angiotensin II in the paraventricular nucleus protects gastric mucosa from ischemia-reperfusion injury [J ]. Brain Res， 2008，1212:25-34.
[8]Bandyopadhyay D， Chattopadhyay A， Ghosh G ， et al. Oxidative stress-induced ischemic heart disease: protection by antioxidants [J]. Curr Med Chem， 2004， 11(3): 369-387.
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