【摘要】 探讨银杏叶提取物(EGb761) 能否通过诱导血红素氧合酶-1(HO-1)活性减轻肺缺血/再灌注损伤。方法 采用呼气末无创血管夹夹闭阻断左主支气管、左肺动脉和左肺静脉30 min后再灌注2 h建立缺血/再灌注(I/R)动物模型。40只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为4组：假手术组、I/R组、EGb组(术前24 h腹腔注射EGb 20 mg/kg)、EGb+ZnPP组(EGb 20 mg/kg +再灌注前15 min静脉注射ZnPP Ⅸ 40 μmol/kg)，检测肺湿重/干重比、肺泡损伤数、肺组织中HO-1的活性和肺组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Pxase)活性变化。结果 ①EGb761明显诱导肺组织HO-1活性增加(P&<0.01)；②同假手术组比较，I/R组肺湿重/干重比及肺泡损伤数增加(P&<0.01)，肺组织GSH-Pxase活性降低(P&<0.01)，缺血/再灌注前用EGb761可逆转上述病理改变(P&<0.01)，用HO-1的抑制剂ZnPP Ⅸ可部分抑制EGb761的保护作用。结论 EGb761通过HO-1的抗氧化作用减轻肺缺血/再灌注损伤。
【关键词】 银杏叶提取物 血红素氧合酶-1 缺血 再灌注损伤 肺 鼠
Abstract: Objective To investigate whether the extract of Ginkgo biloba (EGb761) could attenuate the lung ischemia-reperfusion (I/R) injury by inducing the activation of heme oxygenase-1 (HO-1) in rats. Methods The lung I/R model was established by ligaturing the left lung hilum for 30 min followed by reperfusion for 120 min in the rats. 40 male Sprague-Dawley rats were randomly pided into 4 groups: sham operation group， I/ R group， EGb761 group and EGb+zinc-protoporphyrin-IX (ZnPP Ⅸ) group. The pretreatment with EGb 20 mg/ kg ip and with ZnPP Ⅸ 40 μmol/ kg iv was administered 24 h and 15 min before I/R respectively. The HO-1 activity and GSH-Pxase activity in lung tissue， the lung wet-to-dry weight (W/D) ratio and the number of injured alveoli were determined. Results ①Compared with I/R group， the HO-1 activity was increased markedly in EGb761 group (P&<0.01). ②Compared with the sham operation group， the W/D ratio and the number of injured alveoli were significantly increased in the I/R group (P&<0.01)， but the GSH-Pxase activity was decreased (P&<0.01). Pretreatment with EGb761 before I/R could reverse the above changes， likely through the activation of HO-1， which was， in the present study， partially suppressed by ZnPP Ⅸ， an HO-1 inhibitor. Conclusion EGb761 can ameliorate lung I/R injury in rats significantly by activating the HO-1 in lung tissue.
Key words： extract of Ginkgo biloba; heme oxygenase -1; ischemia/reperfusion injury; lung; rats
近年来，随着心脏手术、器官移植、心肺脑复苏措施的深入开展，体外循环技术在临床上的应用日益增多，对肺缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)损伤，及其所导致的肺功能障碍的发生和防治也逐渐被人们重视。EGb761是从银杏科植物叶子经多步骤分离、纯化获得的一种混合物，成分十分复杂，其主要有效成分为黄酮糖苷类(24%)和萜烯内酯类(6%)。现初步已知，抗氧化作用是EGb的主要药理作用之一。大量体外试验表明，EGb中黄酮类化合物能清除自由基，银杏内酯B(ginkgolinde B，GB)和白果内酯(BB)也有清除自由基的作用［1］。新近研究发现，银杏叶提取物可诱导培养的心肌细胞、神经元和缺血的肾组织表达血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)，并使其活性增加［2-3］。血红素氧合酶-1是一种降解血红素为一氧化碳(carbon monoxide，CO)、铁(Fe)和胆红素的起始酶和限速酶，除了具有降解血红素的功能外，还具有抗炎、抗凋亡、抗氧自由基等多种生理调节功能。近年来的研究表明，HO-1的活性诱导具有抗肺缺血/再灌注损伤的作用［4］。
本实验拟采用大鼠肺“在体暖缺血/再灌注”模型，通过测定肺湿重/干重比及肺泡损伤数、肺组织中HO-1的活性和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Pxase)活性变化，观察EGb761对HO-1活性和肺组织损伤的影响，探讨EGb761对肺缺血/再灌注损伤的防治作用和可能的机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物和试剂 健康Sprague-Dawley大鼠，40只，体重250～300 g，清洁级，由徐州医学院实验动物中心提供。EGb761(金纳多，Ginato)由德国威玛舒培大药厂生产，锌原卟林Ⅸ(ZnPP Ⅸ)为ICN公司产品，HO-1和GSH-Pxase检测试剂盒由南京建成生化试剂公司提供。
1.2 大鼠肺缺血/再灌注模型的建立
1.2.1 模型制备 大鼠20%水合氯醛300～350 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰卧位固定。行颈部正中切口，分离出气管、右侧颈静脉和颈动脉，气管切开、插管，接动物呼吸机行机械通气(吸入室内空气，呼吸频率40次/ min，潮气量10～15 ml/kg)，右侧颈静脉插管、固定，接微量注射泵;然后经左侧第5肋间开胸，游离左肺门，静脉注射肝素100 U。静息5 min后，于呼气末用无创血管夹夹闭阻断左主支气管、左肺动脉和左肺静脉。30 min后开放，进行再灌注2 h。
1.2.2 动物分组及处理 40只大鼠随机分为4组，每组10只:①假手术对照(Sham)组，不阻断肺门；②肺缺血/再灌注(I/R)组；③EGb组，手术前24 h腹腔注射EGb761(5 ml/支，每支含银杏叶提取物17.5 mg，银杏黄酮苷4.2 mg)20 mg/kg，其余步骤同I/R 组；④EGb+ZnPP组，再灌注前15 min静脉注射ZnPPⅨ(40 μmol/ kg)，其余步骤同EGb组。再灌注2 h后处死大鼠。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 肺湿重/干重比测定及肺泡损伤数测定 取部分肺组织生理盐水充分漂洗，滤纸吸干，称重为湿重，70℃、24 h烘干称重为干重，两者之比为肺湿重/干重比。肺组织经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色，显微镜下200倍视野连续观察200个肺泡，计数内含红细胞和白细胞超过2个以上的肺泡(视为损伤肺泡)，然后计算出损伤肺泡的百分数，作为肺泡损伤的定量评价指标。
1.3.2 HO-1活性测定 根据HO-1降解血红素生成胆红素和CO原理，测定样品反应物中胆红素生成量代表HO-1活性。取肺组织，用0.1 mol/L Kh3PO4冷缓冲液(pH 7.4)充分漂洗后，加4倍容积的同种缓冲液，匀浆后低温(4℃)、高速离心15 min(15000 r/min)，去除脂层，收集上清液。-70℃保存的肺匀浆上清液20 μl，加入2 mmol/L正铁血红素40 μl、415 mmol/L NADPH 40 μl，置37℃暗处10 min，之后将反应物置于冰上以终止反应。以不含NADPH的样品作空白对照，样品与空白对照均做双份，在722型分光光度计上用464 nm和530 nm双波长测定胆红素生成量，胆红素摩尔吸光系数为40 mmol/（L·cm）。计算单位蛋白质中HO-1活性。蛋白质含量测定用考马斯亮蓝法。
1.3.3 肺组织GSH-Pxase活性测定 取肺组织，用含有0.16 g/L heparin的生理盐水灌流清除血液后，冰冷生理盐水中洗去浮血，按照约每20 mg组织加入200 μl匀浆液的比例，制备匀浆，4℃、12000 g离心10 min，取上清按照试剂盒说明通过紫外比色法测定GSH-Pxose酶活性。计算单位蛋白质中GSH-Pxase酶活性。以牛血清白蛋白为标准品，用Lowry法测定各样品中蛋白质含量。
1.4 统计学处理 数据经SAS统计软件处理，以±s表示，各组间均数的两两比较用q检验。P&<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 肺湿重/干重比和肺泡损伤数 见表1。表1 4组肺湿重/干重比和肺泡损伤数比较
2.2 HO-1活性测定 见表2。表2 4组HO-1活性比较
2.3 GSH-Pxase活性测定 见表3。表3 4组肺组织GSH-Pxase活性比较
3 讨 论
本实验结果显示，EGb761可明显降低肺缺血30 min再灌注2 h后肺湿重/干重比和肺泡损伤数，说明EGb761对肺缺血/再灌注损伤有保护作用。有研究表明［5］，肺缺血/再灌注0.5 h即表现出明显的再灌注损伤，再灌2 h肺泡损伤数达到高峰。大鼠肺缺血/再灌注后，由于大量自由基产生，导致膜脂质发生过氧化，破坏了膜脂质的代谢和结构，从而改变酶蛋白的微环境。另一方面，自由基也可直接氧化酶蛋白氨基酸残基，引起酶蛋白构象改变，使酶失活。GSH-Pxase在细胞质中直接参与清除h3O2 ，易受氧自由基O+2攻击而失活。本结果证实，大鼠肺缺血/再灌注后GSH-Pxase活性明显低于正常(P&<0.01)。有研究表明［6］，银杏叶提取物中的黄酮苷类化合物是O+2捕捉剂和O+2淬灭剂，参与清除超氧阴离子、抑制脂质过氧化反应，银杏内酯B和白果内酯也有清除自由基的作用。本结果也显示，EGb761(20 mg/kg)处理组的GSH-Pxase活性显著高于缺血/再灌注组(P&<0.01)。提示自由基参与了肺缺血/再灌注早期肺泡细胞的损伤，EGb761通过抑制脂质过氧化反应而保护肺缺血/再灌注损伤。
EGb761诱导HO-1的活性而保护肺缺血/再灌注损伤的机制可能与HO-1具有的多种抗氧化活性有关。HO-1可降解血红素，游离血红素本身是一种强力促氧化剂，可导致活性氧的产生，活性氧的产生又可诱导含血红素蛋白裂解出更多的血红素，由此形成恶性循环。因此，HO-1的活性诱导，可加速清除肺内游离血红素，减少活性氧的产生。在血红素氧化酶代谢产物中，胆红素是一种较强的内源性抗氧化物质，能清除再灌注时产生的氧自由基，减轻细胞膜脂质过氧化损伤［8］；此外，Fe2+作为HO-1的代谢产物，能诱导铁结合蛋白的生成，后者可增加对缺血/再灌注期间产生过多游离Fe2+的结合，减少由Fe2+所介导的氧自由基的生成［9］。本实验观察到EGb组大鼠肺内HO-1的活性被显著诱导，肺组织中总抗氧化能力增强，GSH-Pxase活性显著升高，进一步同时给予HO-1的特异性抑制剂ZnPP Ⅸ则导致GSH-Pxase活性再次降低，表明EGb761通过HO-1的抗氧化作用减轻肺缺血/再灌注损伤。
实验中还观察到，肺湿重/干重比和肺泡损伤数在EGb+ZnPP组虽较EGb组升高，但这些指标仍低于I/R组，表明ZnPP Ⅸ抑制HO-1活性并未完全阻断EGb的保护作用，推测EGb761抗肺缺血/再灌注损伤还有其他机制参与，有待进一步研究。
参考文献
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