【摘要】 研究睾丸灌注超低温冷冻对家兔睾丸功能的影响，探讨移植睾丸的保存方法。方法 通过自体或异体移植，比较低浓度冷冻保护剂活体灌注或体外灌注、高浓度冷冻保护剂活体灌注或体外灌注对兔睾丸冷冻后的完整率、移植成功率、睾酮分泌及精子生成的影响。结果 高浓度冷冻保护剂活体灌注效果最好，冷冻后睾丸完整率为29.3%，血流再通率为79.2%，睾酮分泌接近正常水平，精子生成持续时间可达2个月。结论 采用高浓度冷冻保护剂行活体灌注的方法可有效地保护部分睾丸结构及功能，移植后可产生接近正常水平的睾酮和保持较长时间的生精。
【关键词】 睾丸 移植 超低温冷冻 精子生成 睾酮 兔
Abstract: Objective To study the effect of cryopreservation on the function of transplanted rabbit testicle. Methods The testes were perfused in vivo or in vitro with high-concentration or low-concentration cryoprotectant， and then， cryopreserved. The testis integrity was judged after thawing， the transplant success was decided on the operating table. The testosterone secretion and spermatogenesis were compared later. Results The best results were obtained in the group perfused in vivo with high-concentration cryoprotectant. In this group， the testis integrity rate was 29.3%， the rate of blood vessel recanalization was 79.2%， the secretion of testosterone was close to normal level， and the spermatogenesis continued longer than 2 months. Conclusion By using high-concentration cryoprotectant and in vivo perfusion ， it is likely to effectively protect the structure and function of the graft testis. After transplantation， the testis could secrete testosterone close to normal level and maintain a long-time spermatogenesis.
Key words: testicle; transplantation; cryopreservation; spermatogenesis; testosterone; rabbit
随着器官移植工作的广泛开展，使器官的需求大大增加，仅新鲜器官移植已不能满足日渐增长的临床需要，器官的冷冻保存可使临床器官移植更为方便、快捷，是临床器官移植的有效保障。在既往器官冷冻保存移植工作的基础上［1～3］，我们进行了家兔睾丸的超低温冷冻保存及移植试验。
1 材料和方法
1.1 实验动物及手术方法 10～18月龄性成熟日本大耳白兔（徐州医学院实验动物中心），体重3.5～4.0 kg，按常规方法饲养管理，精子及睾酮检测无异常。
实验动物随机分为低浓度体外、高浓度体外、低浓度活体和高浓度活体4组进行睾丸灌注。睾丸灌注后连同输精管和睾丸动静脉一起采摘后进行冷冻。受体家兔皮下注射速眠新（0.2 ml/kg）麻醉，睾丸动静脉采用11-0尼龙线在手术显微镜下行端端吻合，输精管在手术显微镜下用9-0尼龙线行端端吻合。开放动脉后血流运行达睾丸静脉，则定为血流再通；血流运行通过静脉吻合口并且血运持续10 min以上则定为睾丸移植成功。
1.2 冷冻保护剂的配制 高浓度冷冻保护剂中含有2.5 mol/L甘油和2.5 mol/L二甲基亚砜（DMSO）以及质量浓度为12%的蔗糖；低浓度冷冻保护剂由1.1 mol/L甘油配制。
1.3 睾丸灌注 体外灌注为器官采摘后的灌注，其方法是在睾丸摘除后，经睾丸动脉插管灌注冷冻保护剂，睾丸由肉红色转为淡红色。活体灌注是在器官采摘前完成灌注，其方法是将 27G注射针插入并固定于睾丸动脉内，缓缓将冷冻保护液注入，睾丸在直视下由肉红色迅即变为碧玉色，即为器官完全灌注，随即结扎睾丸静脉，将睾丸摘除。摘除后的睾丸置于冷冻保护液（室温）中再平衡40 min后进入程序冷冻。
1.4 程序冷冻 冷冻过程分为4个降温区段，每个区段使用不同的降温速度，具体如下：①20℃～4℃，降温速率1.5℃/min；②3℃～-17℃，降温速率0.5℃/min；③－18℃～－35℃，降温速率2.5℃/min；④－36℃～－196℃，降温速率4.0℃/min。
1.5 复苏过程 将睾丸从液氮中取出移入37℃解冻液中，温育30 min，然后将其移入室温下的PBS液中，继续温育20 min。如解冻后睾丸外观保持完整，则定为睾丸完整。
1.6 精子采集与计数 当受体家兔性行为恢复后，在自然爬跨过程中用人工阴道采集精液，取部分精子用精子计数板计算总数；刚果红染色后在光镜下观察，不着色者为活精子，被红染的精子为死亡精子，计算活精子占总数的比例为精子活率。
1.7 血浆睾酮水平检测 晨9：00采家兔耳缘静脉血500 μl，天津九鼎生物工程公司放射免疫试剂盒检测血浆睾酮水平。
1.8 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，组间数据进行方差分析，P﹤0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 不同浓度冷冻保护剂及灌注方法对睾丸完整率及血流再通率的影响 不同浓度冷冻保护剂及不同灌注方法对解冻后睾丸的完整率有显著影响，活体灌注和应用高浓度的冷冻保护剂可提高睾丸的完整率。见表1。表1 不同浓度冷冻保护剂及灌注方法对 睾丸完整及血流再通的影响
2.2 睾丸移植 获得28只完整冷冻睾丸。自体移植22只：7只开放血流后睾丸未形成血液循环，1只静脉损伤严重，移植失败；14只移植成功。异体移植6只：1只开放血流后睾丸未形成血液循环，1只静脉血管损伤严重，移植失败；4只移植成功。见表2。表2 冷冻睾丸分组移植情况
2.3 睾酮水平 由于手术打击及疾病等原因，部分家兔术后死亡；由于血管栓塞等原因，部分移植睾丸术后坏死或功能丧失。睾丸移植后，睾丸功能保持的家兔体内的睾酮水平接近正常。见表3。表3 冷冻睾丸移植后睾酮水平
2.4 术后性行为的恢复及精子分析 移植睾丸后，部分家兔7天后即可恢复性行为。自体移植组1例性行为未恢复，1例不射精，1例精液中无精子；异体移植组1例不射精，1例精液中无精子。家兔性行为恢复后间断采精，移植48天之后的精液采集数据见表4。表4 冷冻睾丸移植后精子采集及分析
3 讨 论
早在1949年，Polge就将单细胞的精子成功地冷冻保存。空腔器官的冷冻保存也已有成功的报道［4］。但具有不同组织结构的实体器官睾丸的整体冷冻保存，尚未有突破性进展，多采用薄片或组织块冷冻保存移植［5～7］，无血管及输精管的再吻合，收集精子时往往要分离组织而使组织破坏。Yin等［8］2003年通过吻合血管及输精管而移植的大鼠整体睾丸在42天后出现萎缩，无精子产生且睾酮水平也远低于正常。在我们的研究中，通过对兔睾丸超低温冷冻复苏移植后，获得了正常的活精子和接近正常的睾酮分泌，为生殖器官的冷冻保存作了有益的探索。
冷冻保存睾丸移植的兔在7天左右即恢复了性行为，睾酮的分泌接近正常水平，说明睾丸间质得到有效的保护，睾丸间质细胞不仅存活并具有正常的分泌功能。
兔的精子发生时程约为48天［10］，在Sertoli细胞的参与下由A型精原细胞经过有丝分裂、减数分裂等一系列变化形成精子。冷冻睾丸自体移植兔每次可采得精子（7.4±18.9）×109个/L，异体移植兔每次可采得精子（0.6±0.4）×109个/L，平均每只移植睾丸每日大约可采精子1.00×109个/L。当兔性行为恢复后即对兔反复采精十余次以排除移植前睾丸中残余的精子，之后的连续不断的采集精子达2个月，其中自体移植兔最长可达93天、异体移植兔最长可达124天，均见成熟精子。提示不仅睾丸中的生精细胞及Sertoli细胞得到有效的保护，甚至保存了精原干细胞的部分有丝分裂能力，才能保持如此长时间的生精。
统计比较6只睾丸移植前后的29次采精的精子生成量，移植后平均每只睾丸的精子生成量仅为移植前的4.4%，大部分精子及生精细胞在冷冻解冻移植过程中损伤。因此，还应进一步研究如何提高冷冻保护剂的保护效果，改善冷冻工艺和手术环节，以达到更好的效果。实验中还发现冷冻睾丸异体移植后不仅能产生睾酮，而且精子生成可达124天，这可能是冷冻过程降低了异体睾丸的免疫抗原性，其机制还有待于进一步研究。
参考文献
［1］ 孙贝加，施旭东，王巧莲，等.低温保存兔睾丸72小时自体移植研究［J］.中国优生与遗传杂志，1994，2（2）：26-27.
［2］ 孙贝加，郝易风，施旭东，等.深低温冷冻保存家兔性腺器官的研究［J］.中华泌尿外科杂志，1995，16（4）：232-234.
［3］ 施旭东，孙贝加，郝易白，等.深低温冷冻保存兔脾自体移植研究［J］.徐州医学院学报，1995，15（4）：402-403.
［4］ Song YC， Khirabadi BS， Lightfoot F， et al. Vitreous cryopreservation maintains the function of vascular grafts［J］. Nat Biotechnol， 2000，18(3):296-299.
［5］ Shinohara T， Inoue K， Ogonuki N， et al. Birth of offspring following transplantation of cryopreserved immature testicular pieces and in-vitro microinsemination［J］. Hum Reprod， 2002，17(12)：3039-3045.
［6］ Orwig KE， Schlatt S. Cryopreservation and transplantation of spermatogonia and testicular tissue for preservation of male fertility［J］. J Natl Cancer Inst Monogr，2005，（34）：51-56.
［7］ Honaramooz A， Li MW， Penedo MC， et al. Accelerated maturation of primate testis by xenografting into mice［J］. Biol Reprod， 2004，70(5)：1500-1503.
［8］ Yin H， Wang X， Kim SS， et al. Transplantation of intact rat gonads using vascular anastomosis: effects of cryopreservation， ischaemia and genotype［J］. Hum Reprod， 2003，18(6)：1165-1172.
［9］ Amann RP. Detection of alterations in testicular and epididymal function in laboratory animals［J］. Environ Health Perspect，1986，70：149-158.
［10］ Amann RP. Use of animal models for detecting specific alterations in reproduction［J］. Fundam Appl Toxicol， 1982，2(1)：13-26.