【摘要】 目的 应用科素亚治疗慢性压力负荷性心力衰竭大鼠，探讨其对心肌细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达水平的影响，为心力衰竭发病机制及治疗提供实验依据。方法 30只SD大鼠随机分为心衰组（n=10）、治疗组(n=10)和对照组（n=10），采用鼠腹主动脉缩窄术复制心力衰竭模型。治疗组给予科素亚30 mg·kg-1·d-1 灌胃，心衰组和对照组分别给予等体积生理盐水灌胃；3个月后测量血流动力学指标，原位脱氧核糖核酸酶末端标记法（TUNEL）检测心肌细胞凋亡，免疫组织化学染色法检测心肌Bax、Bcl-2蛋白表达。结果 心衰组与对照组相比，心功能明显减退（P&<0.01），心肌细胞凋亡指数明显增加（P&<0.01），心肌细胞中Bcl-2蛋白表达减少、Bax蛋白表达增加、Bcl-2/Bax比值降低；治疗组与心衰组相比，心室重构改善（P&<0.05），心肌细胞凋亡减少（P&<0.01），心肌细胞中Bcl-2表达增加、Bax表达减少（P&<0.05）。结论 心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡增加与Bcl-2蛋白表达降低、Bax蛋白表达增加有关。减少Bax蛋白表达，同时增加Bcl-2蛋白表达水平，从而抑制心肌细胞凋亡改善心功能，是科素亚治疗心力衰竭的重要机制之一。
【关键词】 心力衰竭 心肌 细胞凋亡 Bcl-2 科素亚
Abstract:Objective To study the effects of cozaar therapy on myocardial apoptosis and expressions of proapoptotic protein Bax and antiapoptotic protein Bcl-2 in rats with chronic pressure overload heart failure (CHF)， and its mechanisms. Methods 30 rats were randomly pided into three groups: CHF group， treatment group and sham operation control group (n=10 each). The rat model of CHF was induced by applying transverse abdominal aortic constriction. Treatment was started 6 weeks after the surgery， with cozaar 30 mg/kg p.o. q.d.for the model rats in treatment group， and with NS for the other 2 groups. By the end of 3 months， the hemodynamic parameters were determined， before the rats were killed to remove the heart. The hearts were dissected and weighed， the apoptosis was assessed by using TUNEL method， the expressions of Bax， and Bcl-2 were determined by immunohistochemistry and image analysis. Results As compared with the control group， the model rats in CHF group showed significant systolic dysfunction (P&<0.01)， increased myocardial apoptosis (P&<0.01)， and elevated expression of Bax and reduced expression of Bcl-2. When the results were compared between the treatment and CHF groups， it was found that cozaar treatment resulted in: improved left ventricular remodeling (P&<0.05); reduced myocardial apoptosis (P&<0.01)， and decreased Bax expression and increased Bcl-2 expression in myocardium (P&<0.05). Conclusion The data show that in CHF， the increase of mycardial apoptosis is related to the elevation of Bax expression and reduction of Bcl-2 expression， while cozaar can ameliorate the systolic dysfunction and restore the myocardial apoptosis by inverting the above processes.
Key words: chronic heart failure; myocardium; apoptosis; Bcl-2; Bax; cozaar
心力衰竭的发生发展机制一直是国内外学者关注的课题，已有研究表明，在心力衰竭发生过程中，心肌细胞凋亡可能起了重要作用［1］。心肌细胞凋亡与神经内分泌细胞因子和凋亡的途径有关，还与凋亡相关基因的表达有关［2］。本研究观察心力衰竭大鼠心肌凋亡指数及其与心功能的关系，旨在探讨应用科素亚治疗心力衰竭对心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及相关基因Bax、Bcl-2蛋白表达水平的影响，从细胞凋亡的角度，进一步探讨科素亚治疗心力衰竭的机制。
1 材料和方法
1.1 主要仪器与试剂 原位细胞凋亡检测（TUNEL）试剂盒（华美生物工程公司产品），小鼠抗大鼠Bax单克隆抗体、小鼠抗大鼠Bcl-2单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司提供），SP免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒（北京中山生物技术有限公司提供），RM-6000型多导生理记录仪（日本光电公司产品）。
1.2 动物心力衰竭模型复制及分组
1.2.1 心力衰竭模型的复制 以腹主动脉缩窄法复制大鼠心力衰竭模型 ［3］ 。大鼠称重，用2.5%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1）腹腔内注射麻醉后，打开腹腔，暴露腹主动脉，并于双侧肾动脉分支上方钝性分离腹主动脉。用7号医用缝合线将直径约0.80 mm的8号去尖注射针头与腹主动脉一起平行结扎，抽出针头，使腹主动脉截面积缩窄为原来的25%～30%，形成腹主动脉狭窄。关腹，术后给予肌内注射青霉素（1 800 U/100 g）3天。
1.2.2 动物分组及处理 SD大鼠共30只，雄性，体重200～250 g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，随机分为心衰组（n=10）、治疗组（n=10）和对照组（n=10）。心衰组、治疗组复制心力衰竭模型，对照组同样分离腹主动脉但不结扎；手术后6周，治疗组给科素亚30 mg·kg-1·d-1灌胃，其余2组给等体积生理盐水灌胃，共6周。
1.3 血流动力学检测指标及方法 喂养3个月（术后12周），大鼠称重，2.5%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1）腹腔内注射麻醉后，分离右侧颈总动脉，聚苯乙烯左心导管插管至左心室，通过压力传感器换能，连接至RM-6000型多导生理记录仪，记录左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末期压（LVEDP）、左心室内压最大上升速度（+dp/dtmax）、左心室内压最大下降速度（-dp/dtmax）；测动脉收缩压（SAP）。
1.4 心肌肥厚检测 测量血流动力学指标后，称体质量（BW），处死大鼠迅速开胸，取出心脏，用冰生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取全心质量（THW）。沿房室沟剪掉两心房，剪掉主、肺动脉根部（结扎结以上部分），紧贴室间隔右侧剪下右心室游离壁，将剩余部分称重，为左心室实际质量（LVW）。全心质量除以体质量为心脏质量指数（THW/BW），左心室质量除以体质量即左心室质量指数（LVW/BW）。
1.5 凋亡心肌细胞检测 心肌细胞凋亡检测采用TUNEL法，主要方法参照试剂盒说明书操作：①左心室组织固定、包埋、切片；②脱蜡；③体积分数0.3%的 h3O2 封闭30 min；④20 mg/L蛋白酶K消化膜蛋白及核蛋白；⑤加TUNEL反应液，37℃孵育70 min；⑥加入抗荧光素抗体；⑦DAB显色，苏木精复染，脱水透明，封片。以不加TdT酶者为阴性对照，分别以用Dnase1（10 mg/L）消化的左心室心肌切片为阳性对照。正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡心肌细胞核呈棕黄色。每只大鼠观察2张切片，每张切片在400倍视野下，随机计数5个不同视野的凋亡细胞及细胞总数，计算凋亡细胞数占总细胞的百分率，取其平均值为凋亡指数(AI)。
1.6 免疫组化法检测心肌凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2 石蜡切片常规脱蜡至水，采用SP免疫组织化学染色法。小鼠抗大鼠Bax单克隆抗体或小鼠抗大鼠Bcl-2单克隆抗体（1∶50稀释），参照免疫组化试剂盒说明书，严格按照SP试剂盒操作步骤行免疫组织化学染色。以PBS代替一抗作阴性对照，DAB显色，苏木精浅染，中性树胶封片镜检，每只大鼠取4张切片染色。阳性结果判断:Bax、Bcl-2阳性为胞质及胞膜内侧出现黄至棕黄色颗粒。每张切片随机取5个高倍视野（×400），计数每个高倍视野内的阳性细胞数和细胞总数，求其平均值。
1.7 统计学处理 所得计量数据以±s表示，采用SPSS 13.0软件进行数据处理，组间差异比较应用Dunnett方法，检验水准：α=0.05。
2 结 果
2.1 血流动力学改变 与对照组相比，心衰组SAP及LVSP均显著降低（P&<0.01），而LVEDP升高（P&<0.01），±dp/dtmax明显降低；说明心室收缩、舒张功能低下，逐渐形成心力衰竭。与心衰组比较，治疗组SAP、LVSP及LVEDP均明显降低（P&<0.05，P&<0.01），+dp/dtmax和-dp/dtmax明显增高（P&<0.01）。见表1。表1 3组血流动力学变化与对照组比较：**P&<0.01；与心衰组比较：#P&<0.05，##P&<0.01
2.2 心脏质量指数、左心室质量指数 与对照组相比，心衰组心脏质量指数、左心室质量指数明显高于对照组（P&<0.01），治疗组以上两指标比心衰组明显降低（P&<0.01）。见表2。表2 各组大鼠的体质量、心脏质量指数、左心质量指数与对照组比较：**P&<0.01；与心衰组比较：#P&<0.05
2.3 心肌细胞凋亡检测结果 与对照组、治疗组相比，心衰组细胞凋亡明显增加(图1、表3)，差异显著（P&<0.01）；治疗组比心衰组细胞凋亡指数显著降低（P&<0.05）。
2.4 Bax、Bcl-2免疫组化染色结果 心衰组Bcl-2表达较对照组明显减少（P&<0.01），治疗组Bcl-2表达比心衰组明显增加（P&<0.05，图2、3）；心衰组Bax表达比对照组明显增加（P&<0.01），治疗组Bax表达比心衰组明显减少（P&<0.05）；心衰组Bcl-2/Bax比值较对照组、治疗组明显降低（P&<0.01）。见表3。表3 各组心肌凋亡指数及Bax、Bcl-2免疫组化结果与对照组比较：**P&<0.01；与心衰组比较：#P&<0.05
3 讨 论
本实验中，心衰组SAP及LVSP均明显降低（P&<0.01），LVEDP明显升高（P&<0.01），+dp/dtmax、-dp/dtmax均降低，说明大鼠心排血量减少，左心收缩、舒张功能明显下降；心衰组心脏质量指数及左心室质量指数增加，提示发生了心肌重构，心室壁增厚。科素亚治疗后，心力衰竭大鼠活动增强，饮食、进水增加，SAP、LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax较心衰组明显改善（P&<0.05，P&<0.01）；心脏质量指数、左心室质量指数较心衰组减少，表明心室重构减轻，心肌肥厚减轻。此结果说明，科素亚治疗改善了大鼠心功能。
科素亚为血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的1型（AT1）受体抑制剂，能特异性地拮抗血管紧张素Ⅱ AT1受体，阻断了循环和局部组织中AngⅡ所致的动脉血管收缩、交感神经兴奋和压力感受器敏感性增加等效应，强力和持续性降低血压，使收缩压和舒张压下降。可减轻左心室肥厚，抑制心肌细胞增生，延迟或逆转心肌重构，改善左心室功能。
心力衰竭是各种心血管疾病的共同归宿，尽管已对心力衰竭的病理生理机制提出了许多学说，但其确切的分子生物学机制尚不十分清楚。心肌细胞是终末分化细胞，细胞增殖相对较少，因此稳定的心肌收缩单元数量对维持心脏泵功能具有重要的意义。在哺乳动物，心肌细胞被认为再生能力极为有限，一定数量心肌细胞的死亡，会影响整个心脏功能［4］。研究表明，凋亡是缺血性和非缺血性心肌病心肌细胞死亡的形式之一，在慢性心力衰竭（CHF）的发生发展中起到重要作用［5］。
Bcl-2家族蛋白是在细胞凋亡过程中起重要作用的一类蛋白质，其调控细胞凋亡的分子机制研究结果表明，线粒体在细胞凋亡过程中起着“主开关”作用，而Bcl-2家族蛋白的主要作用位点就在线粒体膜上［6］。已经证明过度表达的Bcl-2阻止细胞色素C的释放从而阻止了凋亡的传导途径；相反，过度表达的Bax促进了细胞色素C的释放［7］。有凋亡刺激因素的条件下，促凋亡和抗凋亡蛋白的比例是决定细胞命运的一个重要因素。本实验结果中Bcl-2、Bax的表达变化表明，心肌细胞凋亡明显增加与下调抑凋亡基因Bcl-2的表达、上调促凋亡基因Bax的表达有关，也从侧面反映了线粒体途径是心肌细胞凋亡的重要转导途径。从而提示血管紧张素Ⅱ可以经线粒体途径诱发凋亡。这与体外血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞凋亡的研究结果一致［8］。
综上所述，Bcl-2、Bax的调节是心力衰竭心肌细胞凋亡信号转导的重要机制，血管紧张素Ⅱ经线粒体途径诱发凋亡可能参与了心力衰竭心肌细胞凋亡的发生机制，Bcl-2、Bax是线粒体途径中的凋亡调节蛋白；提示在凋亡的早期，调节Bcl-2、Bax蛋白的表达，阻断线粒体途径介导的心肌细胞凋亡，可抑制或逆转心肌重构、改善心功能、延缓或逆转心力衰竭的发生发展。
本研究为科素亚治疗心力衰竭的机制提供了最直接的证据，一方面证明了科素亚通过改变Bcl-2、Bax蛋白表达抑制心肌细胞凋亡，另一方面揭示了心肌细胞凋亡的线粒体途径，为以后针对凋亡关键基因开展基因治疗心力衰竭提供了实验依据。
参考文献
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