【摘要】 目的 研究室旁核注射apelin-13对胃缺血/再灌注(GI/R)损伤的作用及细胞机制。方法 室旁核注射apelin-13，制备GI/R模型；用Western-blot方法检测胃黏膜细胞的凋亡以及凋亡相关基因c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase， JNK)的磷酸化水平。结果 与单纯GI/R组相比，室旁核注射apelin-13能明显增加GI/R后胃黏膜细胞的损伤，同时可以升高caspase-3蛋白表达及JNK的磷酸化水平。结论 室旁核注射apelin-13对大鼠GI/R损伤具有加重作用。
【关键词】 apelin-13 室旁核 胃缺血 再灌注 细胞凋亡 c-Jun氨基末端激酶
Abstract:Objective To observe the effects and mechanism of apelin-13 microinjection into the hypothalamic paraventricular nucleus (PVN) on gastric ischemia/reperfusion (GI/R) injury in rats.Methods Apelin-13 was first microinjected into the PVN before the establishment of GI/R model， which was carried out in rats by clamping the celiac artery for 30 min and the following reperfusion for 1 h. Western-blot was used to determine the expressions of caspase-3 and p-JNK of the gastric mucosal cells.Results Compared with the GI/R control group， apelin-13 microinjection into the PVN markedly aggravated the damage in gastric mucosa and enhanced the expressions of caspase-3 and p-JNK.Conclusion Apelin-13 microinjection into PVN can aggravate the harmful effect on gastric mucosa induced by GI/R.
Key words: apelin-13; paraventricular nucleus (PVN); gastric ischemia/reperfusion (GI/R); cellular apoptosis; JNK
近年来，我们的研究工作表明，下丘脑室旁核(paraventricular nucleus， PVN)对大鼠胃黏膜缺血/再灌注(gastric ischemia/reperfusion， GI/R)损伤具有调节作用，并发现其作用机制与胃黏膜细胞的增殖与凋亡的水平密切相关［1-3］。
1998年，Tatemoto等［4］发现G蛋白耦联受体-血管紧张素受体AT1相关的受体蛋白(putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1， APJR)的内源性配体并命名为apelin(APJ endogenous ligand)。最近研究发现apelin受体广泛分布于大脑，包括视上区、下丘脑视上核和PVN，下丘脑PVN是脑内apelin能神经元胞体和apelin受体相对集中的部位［5］。下丘脑PVN对大鼠GI/R损伤的调节作用是否与apelin及其相应受体有关，这是个非常值得研究的问题。为此，我们采用核团给药手段观察PVN与GI/R损伤之间的关系，并采用免疫印迹技术，观察GI/R损伤后胃黏膜细胞凋亡相关蛋白的表达情况，从而揭示PVN对GI/R损伤的调控机制。
1 材料和方法
1.1 试剂 apelin-13（Sigma公司）；兔抗caspase-3多克隆抗体(Cell-signal公司)； NBT/NCIP显色试剂盒（Promega公司）；抗p-JNK小鼠单克隆抗体、β-actin鼠单克隆抗体（Santa Cruz公司）；碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG、碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG、PowerVisionTM二步法免疫组化检测系统、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、枸橼酸盐缓冲盐溶液(北京中山生物技术有限公司)；其他试剂均为市售化学纯。
1.2 实验动物及分组 4～5月龄、体重230～250 g的健康SD大鼠(徐州医学院实验动物中心提供)，雌雄不拘。大鼠随机分为对照组(Control组)、单纯胃缺血/再灌注组(单纯GI/R组)、PVN给药+胃缺血/再灌注组(apelin-13 0.2 μg +GI/R组)、PVN给溶剂+胃缺血/再灌注组(Vehicle+GI/R组)，每组模型复制成功数均为6只。
1.3 下丘脑PVN注射apelin-13 动物在麻醉下(10%水合氯醛，0.3 ml/100 g)手术，按文献［1-3］方法定位PVN后，在2 min内将0.3 μl(含apelin-13 0.2 μg，或生理盐水)药液缓慢注入。大鼠GI/R模型的制备按文献［6］方法。
1.4 胃黏膜损伤指数测定 参照Guth等［6］方法略加改进。以腺胃区局限于胃上皮的点状糜烂、溃疡、出血灶的长度累积计分：正常为0分，损伤＜1 mm计1分，＞1 mm计2分，＞2 mm计3分，余类推。损伤宽度超过1 mm时分数加倍。每组大鼠损伤分数的平均值为损伤指数。
1.5 蛋白免疫印迹法(immunoblotting assay)测定caspase-3、p-JNK蛋白表达量的变化 按文献［3］方法，将已制备的胞质蛋白提取液各取10 μl测其蛋白浓度后，将各样品用匀浆液稀释至相同浓度，加入1/3体积的4×蛋白变性液95～100℃水浴变性5 min；取等量蛋白样品(50 μg/lane)加入12.5%SDS-PAGE分离后，以湿转移法转至NC膜上，加入封闭液，室温封闭2 h；加入一抗(抗p-JNK抗体1∶200、抗caspase-3抗体1∶1000、抗β-actin抗体1∶500)，4℃过夜，WB洗膜5 min×3次；分别加入相应的碱性磷酸酶标记的二抗(1∶500)，室温孵育2 h，WB洗膜5 min×3次；加入显色剂(NBT/NCIP显色试剂盒)，反应达到要求后，流水洗涤终止反应。
所得显色条带经图像处理仪进行激光扫描、定量分析及打印。对照实验以水代替一抗，其余操作相同。上述因子的蛋白激活水平分别以其免疫反应活性，即免疫印迹中相应区带的光密度(D)值相对于对照组的倍数表示。
1.6 PVN刺激电极定位的鉴定 实验完毕后，快速断头、取脑、固定，在冰冻切片机上作连续冠状切片，采用中性红染色法，根据Paxinos和Watson大鼠脑图谱［7］观察脑片内微量注射器尖端位置，确定部位，定位不准者，结果弃去不用。
1.7 统计学处理 数据以±s表示，多组间比较用完全随机设计方差分析法(ANOVA)，P&<0.05或P&<0.01分别表示两组数据间差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 PVN注射apelin-13对缺血/再灌注胃黏膜损伤指数的影响 PVN注射0.2 μg apelin-13后缺血/再灌注胃黏膜损伤指数为180.26±61.66，与单纯GI/R组(106.14±18.87)和Vehicle+GI/R组(109.00±48.64)相比显著升高（P＜0.01）。
2.2 PVN内微量注射apelin-13对缺血/再灌注胃黏膜细胞caspase-3蛋白表达的影响 apelin-13+GI/R组与单纯GI/R组及Vehicle+GI/R组相比，可以明显增加复灌后胃黏膜caspase-3蛋白表达。apelin-13+GI/R组的胃黏膜细胞caspase-3蛋白表达是单纯GI/R组的174.34%，是Vehicle+GI/R组的205.6%(P&<0.01)。Vehicle+GI/R组与单纯GI/R组差异无统计学意义 (图1，表1)。
2.3 PVN内微量注射apelin-13对缺血/再灌注胃黏膜细胞JNK磷酸化水平的影响 apelin-13+GI/R组与单纯GI/R组及Vehicle+GI/R组相比，可以明显增加GI/R胃黏膜细胞JNK的磷酸化水平。apelin-13+GI/R组的胃黏膜细胞p-JNK是单纯GI/R组的186.66%，是Vehicle+GI/R组的174.69%(P&<0.01) (图1，表1)。
A. caspase-3免疫印迹结果; B. p-JNK免疫印迹结果 表1 PVN内微量注射Apelin-13对缺血/再灌注胃黏膜细胞caspase-3、p-JNK表达的影响(±s， n=6）
指 标 Control组单纯GI/R组 Vehicle+GI/R组 Apelin+GI/R组 caspase-3/β-actin1.00±0.53 2.69±0.35##2.28±0.38##4.68±0.48##**p-JNK/β-actin1.00±0.09 2.11±0.18##2.26±0.23##3.94±0.34##**
与Control组比较：##P&<0.01；与单纯GI/R组比较：**P&<0.01
3 讨 论
传统观念认为，胃的缺血性损伤、应激性溃疡等的形成是应激因素造成胃黏膜坏死的结果。但近年来研究发现，在乙醇、非甾体类抗炎药直接造成的胃黏膜损伤中，胃上皮细胞凋亡明显增加，提示急性胃黏膜损伤中也存在细胞主动死亡过程［8］ 。在本实验中发现PVN注射Apelin-13对缺血/再灌注的胃黏膜损伤有明显加重作用，其作用与增加GI/R胃黏膜细胞的凋亡有关。
在凋亡的过程中，caspase-3是关键的执行分子，在凋亡发生后，它被激活并作为关键性蛋白酶，酶解细胞结构蛋白，切断凋亡细胞与周围细胞的联系，关闭DNA的复制与修复，降解DNA，最后将细胞解体并包裹形成凋亡小体。本实验中使用caspase-3抗体检测胃黏膜细胞凋亡，显示胃黏膜细胞的凋亡与对照组相比明显增多，提示PVN注射Apelin-13对缺血/再灌注的胃黏膜损伤的加重作用与增加GI/R胃黏膜细胞的凋亡有关。
与细胞凋亡的相关基因中，JNK与细胞凋亡关系密切，它参与了多种凋亡相关基因的转录调控。激活的JNK可以通过多种途径激活caspase级联反应，从而启动细胞凋亡。本实验发现， apelin-13+GI/R组与单纯GI/R组相比，JNK的磷酸化水平明显增加，激活的p-JNK通过caspase级联反应促进了胃黏膜细胞的凋亡，可能参与了PVN注射apelin-13对大鼠GI/R损伤的加重作用。但胃黏膜细胞的凋亡是一个多基因调控的相互作用、相互影响的复杂过程，而不是某一种或某一类基因表达的结果，这其中的机制还有待进一步探讨。
【
参考文献
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［4］ Tatemoto K， Hosoya M， Habata Y， et al. Isolation and characterization of a novel endogenous peptide ligand for the human APJR receptor ［J］. Biochem Biophys Res Commun， 1998， 251（2）: 471-476.
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